Un modello murino di trasformazione emorragica indotta da iperglicemia acuta combinata con ischemia focale transitoria

Nella presente ricerca, miriamo a fornire un protocollo completo e dettagliato per stabilire un modello animale altamente riproducibile di trasformazione radicalica umana utilizzando la riperfusione di occlusione dell'arteria cerebrale media in topi C57BL/6 con iperglicemia acuta.

Rispetto ad altre tecniche, il nostro protocollo dimostra una buona ripetibilità, un'elevata stabilità e una bassa mortalità animale, rendendolo adatto per un uso diffuso nella ricerca preclinica della trasformazione emorragica.

In futuro, il nostro obiettivo sarà quello di studiare l'impatto della trasformazione emorragica sulla neurologia e di esplorare il meccanismo sottostante.

[Istruttore] Per iniziare, pulire la piattaforma chirurgica e l'area di lavoro circostante con etanolo al 75%. Accendere l'interruttore del riscaldamento e impostare la temperatura a 37 gradi Celsius. Spostare il topo anestetizzato sulla piattaforma chirurgica in posizione supina e fissarne gli arti con del nastro adesivo. Quindi, 15 minuti prima della procedura chirurgica, somministrare intraperitonealmente glucosio al 30% o soluzione fisiologica ai topi. Usando un bisturi, praticare un'incisione orizzontale con un'apertura di 1,5 centimetri lungo la linea mediana del collo. Eseguire la dissezione smussata all'interno dell'area del triangolo invertito per identificare e separare l'arteria carotide comune sinistra. Usando una pinza oftalmica, sezionare il nervo vago adiacente all'arteria carotide comune e il tessuto mucoso che circonda i vasi sanguigni. Con una sutura assorbibile all'acido poliglicolico 5-0, eseguire una suoneria sull'arteria carotide comune, mantenendo la sutura non tesa. Quindi, separare verso l'alto lungo l'arteria carotide comune. Ora, separa la biforcazione per esporre completamente l'arteria carotide esterna e interna. Avvolgere e legare strettamente una sutura assorbibile all'acido poliglicolico 5-0 attorno all'arteria carotide esterna distalmente dalla biforcazione. Successivamente, utilizzando due morsetti per arteria arteriosa micro serrafine leggeri, bloccare temporaneamente sia l'arteria carotide comune che l'arteria carotide interna per bloccare il flusso sanguigno. Quindi, allungare la fascetta della sutura sull'arteria carotide esterna distale e sull'arteria carotide comune per raddrizzare il segmento dell'arteria carotide esterna. Ora, usa le micro forbici per fare una piccola incisione tra i due lacci di sutura sull'arteria carotide esterna. Inserire una sutura monofilamento rivestita di silicone lunga 30 millimetri nell'arteria carotide esterna. Avvolgere e legare leggermente una seconda sutura assorbibile all'acido poliglicolico 5-0 sull'arteria carotide esterna vicino alla biforcazione per evitare che la sutura monofilamento si allontani. Quindi, tagliare completamente l'arteria carotide esterna distalmente alla legatura permanente e rimuovere il morsetto della pinza arteriosa dall'arteria carotide interna. Successivamente, ritirare la sutura alla biforcazione dell'arteria carotide comune. Ritrarre e ruotare con cautela il moncone esterno dell'arteria carotide. Regolare la direzione della sutura e inserirla da 9 a 10 millimetri dalla biforcazione dell'arteria carotide comune nell'arteria carotide interna per bloccare l'arteria cerebrale media. Quindi, stringere la seconda sutura assorbibile con acido poliglicolico attorno all'arteria carotide esterna e rimuovere il morsetto arterioso dall'arteria carotide comune. Dopo aver anestetizzato nuovamente il topo, utilizzando un morsetto arterioso microclip, bloccare l'arteria carotide comune. Ritrarre parzialmente il monofilamento dall'arteria carotide interna fino a quando la punta rivestita di silicone diventa visibile attraverso l'arteria carotide interna. Quindi, posizionare un altro morsetto per arteria microclip sull'arteria carotide interna sopra la punta rivestita di silicone. Ritirare completamente il monofilamento e legare strettamente il moncone dell'arteria carotide esterna. Infine, rimuovere il morsetto dell'arteria microclip rispettivamente dall'arteria carotide interna e dall'arteria carotide comune. Per iniziare, pulisci la coda del topo con un batuffolo di cotone imbevuto di alcol per rendere la vena della coda completamente iperemica. Usando le forbici chirurgiche, taglia la punta della coda di uno o due millimetri. Spremere delicatamente lungo la radice della coda fino alla punta per facilitare il flusso sanguigno fuori dall'incisione. Quindi, posizionare il serbatoio di assorbimento del campione della carta di prova sul bordo della gocciolina di sangue. Leggi la lettura del glucometro e registra il risultato. Per la misurazione del flusso sanguigno cerebrale, tenere la punta della sonda per flussimetria laser doppler perpendicolare alla superficie del cranio parietale sinistro fino a quando non viene letto un flusso stabile e registrare questo valore. Dopo aver rimosso il cervello del topo MCAO soppresso, posizionare il tessuto cerebrale in una matrice cerebrale di roditore e tagliarlo in fette coronali di due millimetri. Trasferire le fette in una piastra a 24 pozzetti e incubarle con una soluzione di cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio al 2% a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, ritagliare le sezioni di tessuto dalla piastra a 24 pozzetti con una pinza curva e disporle sulla piastra di scansione in vetro. Colorare la fetta fissa del cervello con una soluzione di ematossilina per tre minuti. Differenziarlo immergendo la fetta in alcol di acido cloridrico al 5% per cinque secondi. Quindi, disidratare e ialinizzare la fetta utilizzando soluzioni di etanolo a gradiente e xilene. Montare la sezione con resine neutre. 23 ore dopo l'MCAO, iniettare la soluzione di Evans Blue al 2% nel topo e prelevare il cervello. Dopo aver omogeneizzato e centrifugato il tessuto, trasferire il liquido surnatante in un'altra provetta da centrifuga e diluirlo quattro volte con etanolo. Misurare l'assorbanza del liquido surnatante a 620 nanometri utilizzando uno spettrofotometro. Iniettare FITC-destrano nella vena caudale 24 ore dopo la MCAO e lasciarlo circolare nel sangue per 10 minuti. Dopo aver fissato il tessuto cerebrale, incorporare il tessuto cerebrale utilizzando un composto a temperatura di taglio ottimale e tagliarlo in sezioni spesse 30 micrometri. Trasferire le sezioni su un vetrino da microscopio utilizzando un anello di inoculazione, assicurandosi che aderiscano alla superficie del vetrino. Montare le sezioni di tessuto cerebrale utilizzando un mezzo di montaggio contenente 4',6-diamidino-2-fenilindolo. I livelli di glucosio nel sangue sono aumentati significativamente dopo MCAO nei topi iniettati con glucosio rispetto ai gruppi salini. Non è stato osservato alcun infarto visibile sulle fette di cervello nel gruppo sham con soluzione fisiologica o sham con glucosio. Il gruppo MCAO con glucosio ha mostrato un volume di infarto cerebrale significativamente maggiore rispetto al gruppo MCAO con soluzione fisiologica. Emorragie multiple puntate sono state osservate nell'emisfero ischemico del gruppo MCAO con il gruppo glucosio, che erano assenti negli altri gruppi. Una significativa infiltrazione di cellule del sangue è stata osservata nelle regioni dell'infarto della corteccia e dello striato nel gruppo MCAO con glucosio. La permeabilità al blu di Evans e la perdita di FITC-destrano erano marcatamente più elevate nel gruppo MCAO con glucosio rispetto al gruppo MCAO con soluzione fisiologica.