Name: Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Impara un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi in matrice di collagene 3D per studiare l'interazione tra cellule immunitarie e cancro. Questo metodo permette di analizzare l'invasione cellulare e il ruolo di KIF16B nel microambiente tumorale.

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<meta charset="utf8"></head><body>Esame delle interazioni macrofagi-sferoidi tumorali in una configurazione di matrice di collagene 3D

<ol><li>Lendeckel, U., Venz, S., Wolke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+shapes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ChemTexts%22%5BJournal%5D)">Macrophages: shapes and functions.</a> ChemTexts. 8 (2), 12(2022).</li>
<li>Dallavalasa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumor+associated+macrophages+%28TAMs%29+in+cancer+progression%2C+chemoresistance%2C+angiogenesis+and+metastasis+-+Current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The role of tumor associated macrophages (TAMs) in cancer progression, chemoresistance, angiogenesis and metastasis - Current status.</a> Curr Med Chem. 28 (39), 8203-8236 (2021).</li>
<li>Pan, Y., Yu, Y., Wang, X., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages in tumor immunity.</a> Front Immunol. 11, 583084(2020).</li>
<li>Boutilier, A. J., Elsawa, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Polarization+States+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Macrophage Polarization States in the Tumor Microenvironment.</a> Int J Mol Sci. 22 (13), 6995(2021).</li>
<li>Wenzel, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+transfer+of+cancer+cell+invasiveness+via+endosome-mediated+protease+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Intercellular transfer of cancer cell invasiveness via endosome-mediated protease shedding.</a> Nat Commun. 15 (1), 1277(2024).</li>
<li>Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).</li>
<li>Hey, S., Wiesner, C., Barcelona, B., Linder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF16B+drives+MT1-MMP+recycling+in+macrophages+and+promotes+co-invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">KIF16B drives MT1-MMP recycling in macrophages and promotes co-invasion of cancer cells.</a> Life Sci Alliance. 6 (11), e202302158(2023).</li>
<li>Wu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cancer+cell+invasion%3A+Patterns+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms.</a> Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+insights+and+therapeutic+intervention+of+tumor+metastasis%3A+latest+developments+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Mechanism insights and therapeutic intervention of tumor metastasis: latest developments and perspectives.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 192(2024).</li>
<li>Li, G. N., Livi, L. L., Gourd, C. M., Deweerd, E. S., Hoffman-Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+morphological+changes+of+neuroblastoma+cells+in+response+to+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Genomic and morphological changes of neuroblastoma cells in response to three-dimensional matrices.</a> Tissue Eng. 13 (5), 1035-1047 (2007).</li>
<li>Lin, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cancer+cell+invasion+and+T-cell+cytotoxicity+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture.</a> J Vis Exp. 160, e61392(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>15 &Angiogenesi a micro-vetrino&nbsp;</td><td>ibidi</td><td>81506</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Falloidina&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Microsfere</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubatore</td><td>Legante</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagene I Coda di Ratto&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Anprotec MS01Y71003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Bio& Cella</td><td>FBS. S 0613</td><td></td></tr><tr><td>Figi</td><td>NIH</td><td>ImageJ 2 Versione: 2.3.0 / 1.53s</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide 37%</td><td>252549-500ml</td><td>Linea</td> cellulare Sigma-Aldrich <td></td></tr><tr><td>H1299-GFP</td> Albumina sierica umana Sigma-Aldrich A5843 Leica TCS SP8 X Leica l-glutammina&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di separazione dei linfociti (LSM) 1077</td><td>PromoCell</td><td>C-44010</td><td></td></tr><tr><td>Colonne MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>aminoacidi non essenziali&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penna Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>81275-034</td><td></td></tr><tr><td>TC-Platte 96 pozzo, BIOFLOAT, R&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>83,39,25,400</td><td></td></tr><tr><td>VORTEX-GENE 2&nbsp;</td><td>Industrie scientifiche</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

La Figura 1 mostra uno sferoide H1299-GFP ripreso nei rispettivi giorni di incubazione in una matrice di collagene I. Una rispettiva immagine in campo chiaro, scattata al giorno 0, mostra anche i macrofagi umani primari cocoltivati con lo sferoide. L'immagine rappresentativa registrata il giorno 3 dell'esperimento viene ingrandita dopo l'elaborazione. Sono indicati diversi parametri che possono essere analizzati, tra cui il numero di cellule invasori, i siti di invasione collettiva e il perimetro sferoidale. La tabella inclusa mostra i risultati ottenuti da questa immagine. Il numero di segnali rilevati corrisponde all'impressione visiva. Non sono visibili interruzioni dello sferoide centrale, indicando un'effettiva invasione di singole cellule tumorali piuttosto che cellule derivate da detriti sferoidi. I risultati di diversi sferoidi e condizioni possono ora essere confrontati tramite analisi statistiche.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67374/67374fig01.jpg"> 
Figura 1: Risultati rappresentativi. (Pannello superiore) Imaging sferoidale H1299-GFP al giorno 0, giorno 1, giorno 2 e giorno 3 di incubazione in una matrice di collagene I. (Pannello centrale sinistro) Un'immagine in campo chiaro dello sferoide che mostra i macrofagi umani primari cocoltivati. (Pannello centrale a destra) Un'immagine rappresentativa acquisita al giorno 3 ingrandita dopo l'elaborazione, che mostra i diversi parametri analizzabili (perimetro sferoidale in rosso; tracciato manualmente per una migliore visualizzazione). (Pannello inferiore) I risultati ottenuti dall'immagine nel pannello centrale a destra. Nota: i macrofagi non sono visibili, poiché è stato registrato solo il canale GFP per chiarire il comportamento delle cellule tumorali. Barre di scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67374/67374fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Vogliamo studiare l'interazione tra cancro e cellule immunitarie per capire meglio come interagiscono durante le metastasi. Nella maggior parte dei casi, i modelli in vivo sono il modo di routine per perseguire le domande di ricerca riguardanti l'invasione 3D delle cellule tumorali nel contesto del sistema immunitario, o i componenti isolati del sistema sono al centro dell'attenzione. Un metodo che consente l'analisi del comportamento cellulare che imita la complessità della situazione in vivo, ma consente una manipolazione più diretta di specifiche caratteristiche ambientali al microscopio.Dimostriamo che le cellule tumorali inalterate riducono l'invasione nella matrice di collagene 3D I quando sono co-coltivate insieme a macrofagi che sono stati impoveriti per la proteina motrice KIF16B. Ciò indica un ruolo del riciclo guidato da KIF16B delle proteine di superficie dei macrofagi nel microambiente tumorale. Vorremmo continuare a migliorare il nostro metodo in modo da consentire la visualizzazione della degradazione della matrice all'interfaccia del contesto delle cellule tumorali dei macrofagi, ottenendo così una migliore comprensione dei meccanismi degradativi e adesivi.Per iniziare, coltivare le cellule GFP H1299 con un terreno di coltura tumorale in una fiaschetta di coltura cellulare di 25 centimetri quadrati a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica fino a raggiungere l'80% di confluenza. Lavare le cellule una volta con DPBS e aggiungere un millilitro di tripsina-EDTA per due o tre minuti fino a quando le cellule non si sono staccate. Arresta la reazione enzimatica aggiungendo due millilitri di terreno di coltura delle cellule tumorali.Quindi, centrifugare la sospensione cellulare staccata in una provetta da 15 millilitri a 245 g per cinque minuti. Rimuovere il surnatante contenente la soluzione di tripsina prima di lavare il pellet con cinque millilitri di DPBS. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno cellulare tumorale.Contare le celle utilizzando una camera Neubauer. Trasferire 8.000 cellule in una piastra a bassissima adesione a 96 pozzetti in un volume finale di 25 microlitri di terreno cellulare tumorale. Incubare le cellule per tre giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Dopo tre giorni, controllare l'uniformità degli sferoidi al microscopio. Dopo aver raccolto il campione di sangue umano, trasferire 20 millilitri di sangue da una sacca per trasfusioni in una provetta di reazione da 50 millilitri. Aggiungere 15 millilitri di terreno di separazione dei linfociti in una nuova provetta da 50 millilitri.Trasferire con cautela 20 millilitri di sangue nella provetta contenente il mezzo di separazione dei linfociti senza mescolare e centrifugare la miscela a 450 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Durante la centrifugazione, aggiungere 10 millilitri di RPMI 1640 Medium freddo in una nuova provetta da 50 millilitri. Dopo la centrifugazione, trasferire la fase bianca densa dalla provetta contenente sangue alla provetta contenente RPMI preparata e riempirla fino a 50 millilitri con RPMI freddo.Centrifugare la sospensione a 450 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 10 millilitri di RPMI freddo e riempirlo fino a 50 millilitri con RPMI 1640. Centrifugare nuovamente la miscela e risospendere il pellet in 50 millilitri di RPMI.Ancora una volta, centrifugare il campione e risospendere il pellet cellulare in 1,5 millilitri di tampone monocitario freddo. Quindi, aggiungere 250 microlitri di microsfere anti CD14 nella sospensione cellulare e incubare per 15 minuti con ghiaccio. Durante l'incubazione, preparare una colonna di separazione collegando un filtro a un rack separatore magnetico.Aggiungere 900 microlitri di tampone monocitario nella colonna per l'equilibratura. Dopo l'incubazione, versare la sospensione cellulare sul filtro e lasciarla fluire per gravità in un tubo di scarico. Aggiungere un millilitro di tampone monocitario per lavare la colonna contenente le cellule legate alle perle magnetiche.Sostituire il tubo di scarico sotto la colonna con un tubo nuovo da 50 millilitri contenente 20 millilitri di RPMI. Aggiungere tre millilitri di tampone monocitario alla colonna. Rimuovere la colonna dal rack magnetico e attaccare il timbro.Premere le cellule nella provetta da 50 millilitri preparata e riempirla fino a 30 millilitri con RPMI. Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio Neubauer al microscopio ottico e regolare il numero di cellule su due volte 10 alla potenza di sei cellule per millilitro con RPMI. Seminare un millilitro di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una camera a sei pozzetti e incubare per due o quattro ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.Dopo l'incubazione, controllare se le cellule hanno aderito correttamente e sostituire l'RPMI con 1,5 millilitri di monomedium. Continua l'incubazione per un massimo di sei giorni fino a quando i monociti si differenziano in macrofagi. Dopo aver derivato i macrofagi umani primari dai campioni di sangue del donatore in una piastra a sei pozzetti, aggiungere 500 microlitri di Accutase e incubare per 40 minuti per staccare i macrofagi.Quindi aggiungere 500 microlitri di terreno e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 millilitri per la centrifugazione. Quindi lavare le celle una volta con due millilitri di DPBS e contarle con una camera Neubauer. Diluire il numero desiderato di macrofagi in 40 microlitri di collagene che mescolo e agitare brevemente il tubo.Per lavare gli sferoidi, aggiungere 300 microlitri di DPBS nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Utilizzare una punta per pipetta blu da un millilitro con un'estremità tagliata per raccogliere lo steroide con DPBS. Una volta che lo steroide si è depositato nella punta, spingere brevemente la pipetta sul fondo della camera di imaging per trasferire lo steroide tumorale mediante tensione superficiale.Rimuovere il più possibile la maggior parte dei residui di DPBS trasferiti con lo steroide. Aggiungere rapidamente 40 microlitri di miscela di macrofagi di collagene I sulla camera di imaging contenente steroidi. Incubare la piastra per 30 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in condizioni umide per polimerizzare completamente la miscela di collagene.Dopo la polimerizzazione, aggiungere con cura 25 microlitri di terreno di coltura delle cellule tumorali a ciascun pozzetto e continuare l'incubazione per tre giorni. Acquisire immagini del campione vivo utilizzando un microscopio a scansione laser nei punti temporali desiderati. L'area sferoidale della GFP H1299 è stata misurata in 40.307 micrometri quadrati il terzo giorno di invasione, mentre il perimetro dello sferoide è risultato essere di 1700,17 micrometri, indicando una crescita nel tempo.È stata osservata un'invasione collettiva di cellule tumorali dallo sferoide. Sono state identificate 51 particelle isolate, che fungono da indicatore per l'invasione individuale delle cellule tumorali. Lo sferoide ha mantenuto un rapporto d'aspetto di 1,10 e una circolarità di 0,18, mostrando una bassa deformazione.

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Cancer Research

Ricerca sul cancro

Un test per misurare quantitativamente fattore di crescita trasformante (TGF)-β-indotta invasione in 3-dimensionale gel collagene è descritto. Questo saggio si avvale della MCF10A serie di linee cellulari, che rappresentano diversi stadi di sviluppo del cancro al seno. Questo metodo può essere adottato per essere utilizzato con altre linee cellulari e può essere utilizzato per indagare altri potenziali attivatori o inibitori di invasione.

Saggio sferoide Misura TGF-β-indotta Invasion

Questo video mostra un metodo per stabilire una co-coltura tridimensionale di sferoidi tumorali e cellule T. Viene preparato un calco di agarosio con micropozzetti contenenti sferoidi tumorali, seguito dall'aggiunta di cellule T. Dopo l'incubazione, questa configurazione consente di studiare l'interazione delle cellule T con gli sferoidi tumorali in un ambiente tridimensionale controllato.

Un modello tridimensionale di co-coltura di cellule T infiltranti negli sferoidi tumorali

L'invasione dei tessuti normali circostanti è una caratteristica distintiva dei tumori maligni. Forniamo qui un semplice saggio semi-automatico su micropiastra dell'invasione in una biomatrice 3D naturale che è stata esemplificata con una serie di modelli di tumori umani avanzati.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Questo metodo valuta l'invasione delle cellule tumorali dagli sferoidi in una matrice 3D circostante.  Gli sferoidi vengono generati con il metodo della coltura a goccia sospesa e quindi incorporati in una matrice composta da materiali a membrana basale e collagene di tipo I.  L'invasione degli sferoidi viene successivamente monitorata.

Un Cancer Cell Saggio sferoide valutare Invasion in un Ambiente 3D

Comprendere il comportamento maligno del cancro richiede la creazione di modelli accurati di come le cellule tumorali interagiscono con i componenti del microambiente tumorale, come i macrofagi. Qui descriviamo due metodi per studiare l'interazione delle cellule di glioblastoma con i macrofagi e le microglia associati al tumore, dove viene valutato l'effetto sull'invasione del glioblastoma.

Coculture saggi per studiare macrofagi e microglia stimolazione del glioblastoma Invasion

Il microambiente tumorale è una parte essenziale della crescita e dell'invasione del cancro. Per simulare la progressione del carcinoma, è necessaria una matrice umana biologicamente rilevante. Questo protocollo introduce un miglioramento per il saggio di invasione sferoidale tridimensionale in vitro applicando una matrice a base di leiomioma umano. Il protocollo introduce anche un'analisi di invasione cellulare basata su computer.

Matrice a base di tumore umano in un saggio di invasione sferoide tridimensionale

Questo articolo rappresenta un utile saggio in vitro per valutare la capacità del mezzo condizionato dalle cellule tumorali per attirare i macrofagi.

In Vitro Analisi per studiare l'interazione tumora-macrophage

L'obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un modello in vitro 3D per studiare la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro (CAF) in un ambiente di massa tumorale, che può essere affrontato in diversi sistemi di analisi, come l'immunofluorescenza, la trascrizione l'analisi e l'imaging delle cellule di vita.

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

Qui, presentiamo un metodo utilizzando supporti a membrana permeabili per facilitare lo studio della segnalazione paracrina senza contatto utilizzata dalle cellule tumorali per sopprimere la risposta immunitaria. Il sistema è suscettibile di studiare il ruolo dei fattori secreti sul tumore nell'smorzamento dell'attivazione dei macrofaci.

Studiare gli effetti dei ligandi paracrini setosecreti dal tumore sull'attivazione dei macrofagi utilizzando la co-cultura con i supporti membrana permeabili

L'approccio presentato valuta simultaneamente l'invasione delle cellule tumorali nei saggi dello sferoideo 3D e nella citotossicità delle cellule T. Gli spheroidi sono generati in un cast multi-microwell senza scaffold. La co-coltura e l'incorporamento nella matrice di collagene di tipo I vengono eseguite all'interno dello stesso dispositivo che permette di monitorare l'invasione delle cellule tumorali e la citotossicità mediata a cellule T.

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Presentato qui è un protocollo per la fabbricazione di un dispositivo di imaging sferoide. Questo dispositivo consente l'imaging a fluorescenza dinamica o longitudinale degli sferoidi delle cellule tumorali. Il protocollo offre anche una semplice procedura di elaborazione delle immagini per l'analisi dell'invasione delle cellule tumorali.

Imaging a fluorescenza risolta nel tempo e analisi dell'invasione delle cellule tumorali nel modello sferoide 3D

Impara un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi in matrice di collagene 3D per studiare l'interazione tra cellule immunitarie e cancro. Questo metodo permette di analizzare l'invasione cellulare e il ruolo di KIF16B nel microambiente tumorale.

Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi

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