Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi

Vogliamo studiare l'interazione tra cancro e cellule immunitarie per capire meglio come interagiscono durante le metastasi. Nella maggior parte dei casi, i modelli in vivo sono il modo di routine per perseguire le domande di ricerca riguardanti l'invasione 3D delle cellule tumorali nel contesto del sistema immunitario, o i componenti isolati del sistema sono al centro dell'attenzione. Un metodo che consente l'analisi del comportamento cellulare che imita la complessità della situazione in vivo, ma consente una manipolazione più diretta di specifiche caratteristiche ambientali al microscopio.

Dimostriamo che le cellule tumorali inalterate riducono l'invasione nella matrice di collagene 3D I quando sono co-coltivate insieme a macrofagi che sono stati impoveriti per la proteina motrice KIF16B. Ciò indica un ruolo del riciclo guidato da KIF16B delle proteine di superficie dei macrofagi nel microambiente tumorale. Vorremmo continuare a migliorare il nostro metodo in modo da consentire la visualizzazione della degradazione della matrice all'interfaccia del contesto delle cellule tumorali dei macrofagi, ottenendo così una migliore comprensione dei meccanismi degradativi e adesivi.

Per iniziare, coltivare le cellule GFP H1299 con un terreno di coltura tumorale in una fiaschetta di coltura cellulare di 25 centimetri quadrati a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica fino a raggiungere l'80% di confluenza. Lavare le cellule una volta con DPBS e aggiungere un millilitro di tripsina-EDTA per due o tre minuti fino a quando le cellule non si sono staccate. Arresta la reazione enzimatica aggiungendo due millilitri di terreno di coltura delle cellule tumorali.

Quindi, centrifugare la sospensione cellulare staccata in una provetta da 15 millilitri a 245 g per cinque minuti. Rimuovere il surnatante contenente la soluzione di tripsina prima di lavare il pellet con cinque millilitri di DPBS. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno cellulare tumorale.

Contare le celle utilizzando una camera Neubauer. Trasferire 8.000 cellule in una piastra a bassissima adesione a 96 pozzetti in un volume finale di 25 microlitri di terreno cellulare tumorale. Incubare le cellule per tre giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo tre giorni, controllare l'uniformità degli sferoidi al microscopio. Dopo aver raccolto il campione di sangue umano, trasferire 20 millilitri di sangue da una sacca per trasfusioni in una provetta di reazione da 50 millilitri. Aggiungere 15 millilitri di terreno di separazione dei linfociti in una nuova provetta da 50 millilitri.

Trasferire con cautela 20 millilitri di sangue nella provetta contenente il mezzo di separazione dei linfociti senza mescolare e centrifugare la miscela a 450 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Durante la centrifugazione, aggiungere 10 millilitri di RPMI 1640 Medium freddo in una nuova provetta da 50 millilitri. Dopo la centrifugazione, trasferire la fase bianca densa dalla provetta contenente sangue alla provetta contenente RPMI preparata e riempirla fino a 50 millilitri con RPMI freddo.

Centrifugare la sospensione a 450 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 10 millilitri di RPMI freddo e riempirlo fino a 50 millilitri con RPMI 1640. Centrifugare nuovamente la miscela e risospendere il pellet in 50 millilitri di RPMI.

Ancora una volta, centrifugare il campione e risospendere il pellet cellulare in 1,5 millilitri di tampone monocitario freddo. Quindi, aggiungere 250 microlitri di microsfere anti CD14 nella sospensione cellulare e incubare per 15 minuti con ghiaccio. Durante l'incubazione, preparare una colonna di separazione collegando un filtro a un rack separatore magnetico.

Aggiungere 900 microlitri di tampone monocitario nella colonna per l'equilibratura. Dopo l'incubazione, versare la sospensione cellulare sul filtro e lasciarla fluire per gravità in un tubo di scarico. Aggiungere un millilitro di tampone monocitario per lavare la colonna contenente le cellule legate alle perle magnetiche.

Sostituire il tubo di scarico sotto la colonna con un tubo nuovo da 50 millilitri contenente 20 millilitri di RPMI. Aggiungere tre millilitri di tampone monocitario alla colonna. Rimuovere la colonna dal rack magnetico e attaccare il timbro.

Premere le cellule nella provetta da 50 millilitri preparata e riempirla fino a 30 millilitri con RPMI. Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio Neubauer al microscopio ottico e regolare il numero di cellule su due volte 10 alla potenza di sei cellule per millilitro con RPMI. Seminare un millilitro di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una camera a sei pozzetti e incubare per due o quattro ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Dopo l'incubazione, controllare se le cellule hanno aderito correttamente e sostituire l'RPMI con 1,5 millilitri di monomedium. Continua l'incubazione per un massimo di sei giorni fino a quando i monociti si differenziano in macrofagi. Dopo aver derivato i macrofagi umani primari dai campioni di sangue del donatore in una piastra a sei pozzetti, aggiungere 500 microlitri di Accutase e incubare per 40 minuti per staccare i macrofagi.

Quindi aggiungere 500 microlitri di terreno e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 millilitri per la centrifugazione. Quindi lavare le celle una volta con due millilitri di DPBS e contarle con una camera Neubauer. Diluire il numero desiderato di macrofagi in 40 microlitri di collagene che mescolo e agitare brevemente il tubo.

Per lavare gli sferoidi, aggiungere 300 microlitri di DPBS nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Utilizzare una punta per pipetta blu da un millilitro con un'estremità tagliata per raccogliere lo steroide con DPBS. Una volta che lo steroide si è depositato nella punta, spingere brevemente la pipetta sul fondo della camera di imaging per trasferire lo steroide tumorale mediante tensione superficiale.

Rimuovere il più possibile la maggior parte dei residui di DPBS trasferiti con lo steroide. Aggiungere rapidamente 40 microlitri di miscela di macrofagi di collagene I sulla camera di imaging contenente steroidi. Incubare la piastra per 30 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in condizioni umide per polimerizzare completamente la miscela di collagene.

Dopo la polimerizzazione, aggiungere con cura 25 microlitri di terreno di coltura delle cellule tumorali a ciascun pozzetto e continuare l'incubazione per tre giorni. Acquisire immagini del campione vivo utilizzando un microscopio a scansione laser nei punti temporali desiderati. L'area sferoidale della GFP H1299 è stata misurata in 40.307 micrometri quadrati il terzo giorno di invasione, mentre il perimetro dello sferoide è risultato essere di 1700,17 micrometri, indicando una crescita nel tempo.

È stata osservata un'invasione collettiva di cellule tumorali dallo sferoide. Sono state identificate 51 particelle isolate, che fungono da indicatore per l'invasione individuale delle cellule tumorali. Lo sferoide ha mantenuto un rapporto d'aspetto di 1,10 e una circolarità di 0,18, mostrando una bassa deformazione.