Knockdown genico efficiente nel fegato tramite iniezione intrasplenica di piccolo RNA a forcina veicolato dal virus adeno-associato sierotipo 8 (AAV8)
1 novembre 2024
Questo protocollo descrive come l'iniezione intrasplenica di small hairpin RNA erogato da AAV8 raggiunga la stessa efficienza di knockdown genico nel fegato dell'iniezione della vena porta, rappresentando una procedura più semplice con mortalità e complicanze perioperatorie e postoperatorie molto più basse.
Il nostro obiettivo di ricerca è migliorare la comprensione della progressione di un disturbo complesso utilizzando metodi computazionali e sperimentali. Ci concentriamo sullo sviluppo di strategie per rallentare o invertire la progressione di malattie complesse come i disturbi metabolici, l'invecchiamento e il cancro. La domanda chiave che stiamo cercando di affrontare qui è perché alcune lesioni precancerose si sviluppano in cancro, perché alcuni tessuti adulti possono raggiungere la rigenerazione dopo una lesione e cosa sta guidando il processo di invecchiamento. Queste tecnologie includono il sequenziamento dell'intero genoma, il sequenziamento di singole cellule, un robusto algoritmo computazionale e di apprendimento automatico, la modellazione dell'intelligenza artificiale e modelli animali sperimentali rilevanti per le malattie umane. Questo protocollo descrive un metodo per il knockdown genico in vivo utilizzando iniezioni intraspleniche di AAV8, costrutto di RNA a forcina corta somministrato mirato allo stemming nucleare. Lo stemming nucleare è un fattore di autorinnovamento delle cellule staminali che svolge un ruolo importante nello sviluppo embrionale, nello sviluppo del cancro e nella rigenerazione dei tessuti adulti. Abbiamo dimostrato che nelle iniezioni di trapianto di AAV8 l'RNA a forcina corta raggiunge la stessa efficienza di knockdown. Una serie di iniezioni di AAV8 nella vena porta fornisce un costrutto, ma è associato a molte meno complicazioni e la procedura è molto più semplice.
[Istruttore] Per iniziare, trasferire i topi anestetizzati nell'area chirurgica asettica in posizione sdraiata laterale destra. Utilizzando una lama chirurgica, praticare un'incisione di 15 millimetri sulla parete addominale superiore sinistra, seguita da un'incisione di 10 millimetri sul peritoneo. Usando una pinza, esponi delicatamente la milza e posiziona un pezzo di garza bagnata sotto di essa per tenerla in posizione. Successivamente, utilizzando un ago da 30 gauge, iniettare 50 microlitri di virus AAV8 nella milza a una profondità di tre millimetri sotto la superficie per un periodo di 30 secondi. Quindi coprire il sito con un batuffolo di cotone e comprimerlo per un minuto. Successivamente, suturare la parete addominale utilizzando una sutura assorbibile 4-0. Quindi chiudere la pelle utilizzando una sutura 4-0 non assorbibile. Dopo l'anestetizzazione, i topi eseguono una laparotomia praticando un'incisione sulla linea mediana sulla pelle e poi nel peritoneo. Posizionare una garza sterile imbevuta di soluzione fisiologica sterile sul lato sinistro del mouse. Usando un batuffolo di cotone sterile, estrarre delicatamente l'intestino crasso e tenue. Metti l'intestino sopra una garza bagnata e coprili per evitare che si secchino o entrino in contatto con la pelle. Quindi, utilizzando un ago sterile calibro 32, iniettare 50 microlitri di virus AAV8 nella vena porta con un angolo inferiore a cinque gradi. Inserire l'ago da tre a cinque millimetri nella vena porta e lasciare che il sangue scorra oltre l'ago per cinque secondi per evitare il riflusso. Successivamente, posizionare un batuffolo di cotone sterile sul sito di iniezione e applicare una leggera pressione fino a quando la vena non è completamente chiusa e non si verifica sanguinamento. Successivamente, rimetti delicatamente gli organi interni nella cavità addominale. Quindi, chiudere la parete addominale utilizzando una sutura riassorbibile 4-0 e la pelle con sutura 4-0 non assorbibile. Le iniezioni intraspleniche e della vena porta hanno mostrato un'efficienza di knockdown dell'mRNA statisticamente equivalente senza differenze significative osservate tra i due metodi.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per la silenziamento genico in vivo mediante iniezioni intraspleniche di RNA a forcina corta veicolato da AAV8. Questo approccio raggiunge un'efficienza di silenziamento genico nel fegato paragonabile a quella dell'iniezione nella vena porta, risultando però più semplice e associata a minori complicazioni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Terapia genica
- Neuroscienze
- Medicina rigenerativa
Sfondo
- Comprendere le tecniche di silenziamento genico è fondamentale per lo studio delle malattie complesse.
- AAV8 è un vettore virale utilizzato per il trasferimento di materiale genetico.
- I fattori di staminalità nucleare sono importanti in diversi processi biologici.
- Minimizzare le complicanze chirurgiche è essenziale per migliorare i risultati sperimentali.
Scopo dello studio
- Confrontare l'efficacia delle iniezioni intraspleniche rispetto a quelle della vena porta per l'abbattimento genico.
- Semplificare la procedura mantenendone l'efficacia.
- Ridurre le complicanze perioperatorie e postoperatorie.
Metodi Utilizzati
- Iniezione intrasplenica di RNA a forcina corta veicolato da AAV8.
- Iniezione nella vena porta di AAV8 come metodo comparativo.
- Utilizzo di topi anestetizzati per procedure chirurgiche.
- Analisi statistica per confrontare l'efficienza di silenziamento genico.
Risultati principali
- Entrambi i metodi di iniezione hanno raggiunto un'efficienza di silenziamento genico statisticamente equivalente.
- L'iniezione intrasplenica è stata associata a un numero minore di complicazioni.
- La procedura si è rivelata più semplice rispetto all'iniezione nella vena porta.
- I risultati sostengono l'uso dell'iniezione intrasplenica come alternativa praticabile.
Conclusioni
- L'iniezione intrasplenica di AAV8 è un metodo efficace per l'abbattimento genico.
- Questo metodo può potenziare la ricerca nella terapia genica e nella medicina rigenerativa.
- Studi futuri potrebbero esplorare gli effetti a lungo termine di questa tecnica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Un'efficace e minimamente invasiva riduzione dell'espressione genica nel fegato è fondamentale per la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nella ricerca metabolica, rigenerativa e oncologica. Il protocollo di somministrazione intrasplenica di AAV8-shRNA consente un efficace silenziamento genico con ridotto rischio procedurale, sostenendo genetica funzionale ad alta affidabilità in modelli pertinenti alla malattia. Questo approccio semplifica le fasi iniziali della scoperta e i flussi di lavoro preclinici riducendo le barriere tecniche e le complicanze perioperatorie.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'interrogazione funzionale di geni bersaglio nella patofisiologia epatica mediante modelli in vivo.
- Consente la riduzione dei rischi meccanicistici fornendo un silenziamento genico affidabile con effetti fuori bersaglio minimi.
- Facilita la verifica rapida di ipotesi sulla funzione genica in percorsi metabolici e rigenerativi.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un sistema validato per la generazione di modelli di silenziamento genico adatti allo screening di composti.
- Garantisce una riduzione riproducibile e quantitativa dell'espressione genica, supportando la standardizzazione dei saggi.
- Riduce la variabilità procedurale, migliorando la scalabilità e il riutilizzo della piattaforma per multipli bersagli.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a sistemi in vivo pertinenti per la malattia al fine di scoprire biomarcatori traslazionali.
- Garantisce continuità dalla fase iniziale della scoperta fino alla validazione preclinica, consentendo una modulazione genica costante.
- Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, riducendo al minimo fattori confondenti tecnici e biologici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo intrasplenico con AAV8-shRNA si inserisce nel percorso dalla scoperta allo sviluppo preclinico, consentendo una valida conferma dell'obiettivo e la generazione di modelli per l'identificazione di composti promettenti e studi traslazionali.
- Biologia della scoperta: Accelerare la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi consentendo un rapido abbattimento genico in vivo.
- Screening: Fornisce un silenziamento genico riproducibile, supportando la prontezza del saggio e la generazione di output quantitativi.
- Analisi: Offre misurazioni statisticamente robuste della riduzione dell'espressione genica per l'analisi comparativa.
- Ricerca traslazionale: Garantisce una modulazione genica rilevante per la malattia nei modelli preclinici, supportando l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo standardizzato e a bassa complessità, adattabile a diversi bersagli genici e modelli di malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità, la standardizzazione e la sicurezza procedurale nei flussi di lavoro di silenziamento genico.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione del progetto e l'efficienza del capitale riducendo i tassi di fallimento tecnico.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione e un avanzamento basati sul rischio dei bersagli validati all'interno dei percorsi preclinici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in chirurgia su piccoli animali e manipolazione di vettori virali.
- Necessita dell'accesso a piattaforme per la produzione di AAV8 e per l'analisi quantitativa dell'espressione genica.
- Richiede una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per l'esecuzione del protocollo e l'interpretazione dei dati.
- È adattabile a diversi geni bersaglio, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione per modelli di malattia differenti.
- Le limitazioni potenziali includono l'immunogenicità del vettore e i vincoli procedurali specifici del modello.
