Name: Sfruttare il potere dei carichi di microRNA in piccole vescicole extracellulari rilasciate da sezioni di cervello umano appena congelate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Scopri un metodo efficiente per estrarre vescicole extracellulari da tessuto cerebrale umano congelato e analizzare il carico di microRNA. Questo protocollo riproducibile facilita l'identificazione di biomarcatori per la diagnosi precoce di demenze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Isolamento efficiente delle sEV cerebrali da un tessuto minimo per la scoperta di biomarcatori

<ol><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
<li>Fornari, S., Schäfer, A., Jucker, M., Goriely, A., Kuhl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+spreading+of+Alzheimer%27s+disease+within+the+brain%27s+connectome%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Prion-like spreading of Alzheimer's disease within the brain's connectome.</a> J R Soc Interface. 16 (159), 20190356(2019).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+small+extracellular+vesicles+in+cancer+invasion+and+metastasis%3A+molecular+mechanisms%2C+and+clinical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived small extracellular vesicles in cancer invasion and metastasis: molecular mechanisms, and clinical significance.</a> Mol Cancer. 23 (1), 18(2024).</li>
<li>Constantinides, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+A%CE%B242+and+A%CE%B242%2F+A%CE%B240+ratio+in+Alzheimer%27s+disease+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">CSF Aβ42 and Aβ42/ Aβ40 ratio in Alzheimer's disease and frontotemporal dementia.</a> Diagnostics. 13 (4), 783(2023).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+serum+miRNA+biomarkers+associated+with+Alzheimer%27s+disease+shows+concordance+with+neuropsychological+and+neuroimaging+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Prognostic serum miRNA biomarkers associated with Alzheimer's disease shows concordance with neuropsychological and neuroimaging assessment.</a> Mol Psychiatry. 20 (10), 1188-1196 (2015).</li>
<li>Roser, A. E., Caldi Gomes, L., Schünemann, J., Maass, F., Lingor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miRNAs+as+diagnostic+biomarkers+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circulating miRNAs as diagnostic biomarkers for Parkinson's disease.</a> Front Neurosci. 12, 625(2018).</li>
<li>Jackson, N., Guerrero-Muñoz, M. J., Castillo-Carranza, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prion-like+transmission+of+tau+oligomers+via+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The prion-like transmission of tau oligomers via exosomes.</a> Front Aging Neurosci. 14, 974414(2022).</li>
<li>Vella, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
<li>Yousif, G., Qadri, S., Parray, A., Akhthar, N., Shuaib, A., Haik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+neuronal+markers%3A+Immunoaffinity+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Med%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived neuronal markers: Immunoaffinity isolation and characterization.</a> Neuromolecular Med. 24 (3), 339-351 (2022).</li>
<li>Kumar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+microfluidic+approaches+for+the+isolation+and+detection+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22TRAC-Trend+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in microfluidic approaches for the isolation and detection of exosomes.</a> TRAC-Trend Anal Chem. 159, 116912(2023).</li>
<li>Ransom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+brain+small+extracellular+vesicles+contain+selectively+packaged%2C+full-length+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human brain small extracellular vesicles contain selectively packaged, full-length mRNA.</a> Cell Rep. 43 (4), 114061(2024).</li>
<li>Gomes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+isolation+method+for+spontaneously+released+extracellular+vesicles+from+brain+tissue+and+its+implication+for+stress-driven+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">A novel isolation method for spontaneously released extracellular vesicles from brain tissue and its implication for stress-driven brain pathology.</a> Cell Commun Signal. 21 (1), 35(2023).</li>
<li>Welsh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28MISEV+2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV 2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2023).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Pirisinu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+journey+of+extracellular+vesicles+towards+global+scientific+acclamation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">The long journey of extracellular vesicles towards global scientific acclamation.</a> Adv Pharm Bull. 13 (3), 489-501 (2023).</li>
<li>Bender, A., Sullivan, B. P., Lillis, L., Posner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+and+chemical-based+methods+to+inactivate+endogenous+blood+ribonucleases+for+nucleic+acid+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Enzymatic and chemical-based methods to inactivate endogenous blood ribonucleases for nucleic acid diagnostics.</a> J Mol Diagn. 22 (8), 1030-1040 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Merck</td><td>A9418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Maschera cellulare Colorazione della membrana plasmatica arancione</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo III</td><td>StemCell Technologies</td><td>07422</td><td></td></tr><tr><td>Colonne ExoSpin e sistemi di</td><td>guida delle cellule tampone Ltd.</td><td>EX01-50</td><td>Questo kit contiene le colonne SEC utilizzate in questo esperimento, il tampone di precipitazione e il PBS privo di EV.</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi Halt (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-E Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1247601</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer (4x)</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Lexogen Small RNA-Seq Library Prep Kit</td><td>Lexogen</td><td>052.24</td><td>Questo kit contiene una scatola di reagenti per la preparazione di piccoli RNA con piastra di primer i7 Index.&nbsp;</td></tr><tr><td>miRNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Questo kit contiene un reagente di lisi per il recupero dell'RNA di alta qualità (Qiazol), colonne di isolamento dell'RNA, tamponi di isolamento (RWT, RPE) e acqua priva di RNasi.</td></tr><tr><td>Kit di reagenti MiSeq v3</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td>Questo è il kit di preparazione Illumina</td></tr><tr><td>Membrana in nitrocellulosa, 0,45 &; m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88018</td><td></td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 anti-umano CD63 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>143914</td><td>Utilizzato per l'analisi fNTA</td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 anti-umano CD81 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>349520</td><td>Utilizzato per l'analisi fNTA</td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 anti-umano CD9 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>312118</td><td>Utilizzato per l'analisi fNTA</td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Merck</td><td></td><td></td>Kit</tr> per <tr><td>il dosaggio delle proteine BCA 4906845001 Pierce</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td> Kit <td></td> per il dosaggio del microRNA <td>ThermoFisher Scientific</td> 25530049 <td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1X Kit per il test DSNA HS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorimetro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Tampone di lisi ed estrazione</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>RNasi A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Substrato di massima sensibilità</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr></tbody></table>

sfruttare il potere dei carichi di microrna in piccole vescicole extracellulari rilasciate da sezioni di cervello umano appena congelate 

Harnessing the Power of MicroRNA Cargoes in Small Extracellular Vesicles Released from Fresh-Frozen Human Brain Sections

Per confermare la presenza di BDsEVsEV, sono state utilizzate tre tecniche: western blotting, NTA e TEM (Figura 3). I risultati del Western blot (Figura 3A e File supplementare 1) mostrano la presenza di tutti e cinque i marcatori positivi (CD9, CD63, CD81, Flot-1 e TSG101) e l'assenza di Calnexina nelle sEV (utilizzate come controllo negativo), confermando l'assenza di contaminazione con il contenuto cellulare. Come previsto, gli omogeneizzati cerebrali (BH) mostrano più proteine di quelle osservate nelle sEV per i marcatori testati. Le immagini TEM hanno confermato la morfologia delle BDsEV e la loro dimensione relativa all'interno del campione (Figura 3B), che è stata ulteriormente confermata dall'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (Figura 3C).
La Figura 3C (pannello superiore) mostra le dimensioni delle particelle isolate comprese tra 50 e 200 nm. Dai dati NTA, prendendo il risultato della dispersione come il 100% delle particelle rappresentate, CMO rappresenta circa il 52,35% delle particelle (Figura 3C, pannello inferiore) che hanno un doppio strato lipidico. Di queste particelle colorate con CMO, il 34,66% conteneva CD9, il 15,49% conteneva CD63 e il 12,01% conteneva CD81. Fare riferimento al file supplementare 2 per i dati di controllo NTA.
I dati di quantificazione dell'RNA isolato (Tabella 2) mostrano livelli compresi tra 3,24 e 8,76 (ng/μL), valori che sono stati normalizzati durante la generazione delle librerie di cDNA. I risultati del test TapeStation (Figura 4) mostrano picchi importanti di circa 120-160 bp, con picchi più piccoli inferiori a circa 50 bp e altri picchi più piccoli superiori a circa 484 bp.
I controlli di qualità per i dati di sequenziamento di nuova generazione mostrano letture di altissima qualità dopo il taglio dell'adattatore (Figura 5A). Tutte le posizioni di sequenza mostrano un punteggio Phred di &gt;30, che indica tassi di errore inferiori a 1 su 1000 nucleotidi. La Figura 5B mostra che la maggior parte delle sequenze si aggira intorno a 21-22 bp, corrispondendo all'intervallo di dimensioni previsto per i microRNA. Attraverso un'ulteriore mappatura a valle (utilizzando BowTie2), utilizzando il biotool di analisi flagstat di Samtools, su 1.304.100 sequenze allineate, 1.116.264 (85%) sono state mappate nelle regioni dei microRNA nel genoma umano (build hg38; Tabella 3).
Del totale dei miRNA, 808 miRNA sono stati espressi attraverso tutti e 3 i campioni, con 344 miRNA condivisi tra tutti e tre i campioni (~43%), 5 condivisi tra il controllo 1 e il controllo 2, 183 condivisi tra il controllo 1 e il controllo 3 e 16 condivisi tra il controllo 2 e il controllo 3 (Figura 6). Da questi dati, i miRNA espressi più alti in tutti e tre i BDsEV sono has-let-7b-5p, has-miR-143-3p, has-miR-30a-5p, has-miR-221-3p e has-let7i-5p. Allo stesso modo, i primi 5 miRNA espressi in modo meno differenziale nei campioni di BDsEV (letture &gt;10) sono has-miR-128-2-5p, has-miR-182-5p, has-miR-193b-5p, has-miR-448 e has-miR-505-3p. Tutti i conteggi delle letture grezze e normalizzati sono riportati nel file supplementare 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig01.jpg"> 
Figura 1: Flusso di lavoro per l'elaborazione dei tessuti. La figura mostra il processo graduale per l'isolamento di sEV derivate dal cervello (BDsEV) da sezioni cerebrali appena congelate utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig02.jpg"> 
Figura 2: Flusso di lavoro per l'isolamento dell'RNA da BDsEVsEVs. La figura mostra il processo graduale di isolamento dell'RNA totale dalle BDsEVsEV, inclusa la fase di pre-trattamento di rimozione di qualsiasi RNA extracellulare utilizzando la proteinasi K e la RNasi A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig03.jpg"> 
Figura 3: Flusso di lavoro di caratterizzazione BDsEV. La figura mostra vari metodi per caratterizzare i BDsEV. (A) Western blot per rilevare marcatori proteici specifici per sEV. BH Cervello omogeneizzato. La calnexina è un controllo negativo per le sEV: l'assenza in sEV e la presenza in BH confermano la purezza del campione di sEV. Per altri marcatori, come previsto, la quantità di proteine è maggiore in BH rispetto ai campioni sEV (20 μg di proteina caricata per pozzetto). (B) Immagine rappresentativa al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) per BDsEV su scala 200 μM, che conferma la morfologia attesa con una membrana a doppio strato lipidico. (C) Grafico della distribuzione dimensionale per l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) per tutte le particelle (pannello superiore). Ogni punto dati rappresenta la variazione tra tre repliche. Proporzioni normalizzate per particelle biologiche (sEV) e proporzioni relative per specifici marcatori di superficie (pannello inferiore) (dati mostrati come media ± SEM dei pozzetti triplicati (n = 3)). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig04.jpg"> 
Figura 4: Controllo di qualità per la preparazione della libreria di cDNA. Analisi con tapestation per singoli campioni dopo la preparazione della libreria di cDNA. I picchi visualizzati in ciascun grafico mostrano la dimensione di ciascuna preparazione (asse orizzontale, in bp) e la rispettiva intensità di ciascun picco (asse verticale, FU). La libreria di piccoli RNA prevista raggiunge picchi intorno a 120-160 bp, come si vede nella figura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig05.jpg"> 
Figura 5: Controllo di qualità per il sequenziamento miRnome. (A) Grafico FASTQC per la qualità di lettura dei singoli campioni dopo il taglio dell'adattatore. L'asse orizzontale è per la posizione nucleotidica e l'asse verticale è per i punteggi Phred. I box plot per ogni posizione mostrano la distribuzione del punteggio Phred in tutte le letture per ogni posizione. Tutte le distribuzioni all'interno della zona verde confermano dati di altissima qualità (&gt;Q30) che implicano una preparazione del campione di alta qualità. (B) La distribuzione della lunghezza della sequenza per ciascun campione mostra che per tutti e tre i campioni, la maggior parte delle letture era di circa 21-22 nucleotidi, l'intervallo di dimensioni previsto per i microRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig06.jpg"> 
Figura 6: Sovrapposizione dell'espressione dei MicroRNA in tutti i campioni. Il numero di miRNA rilevati da ciascun campione (conteggio delle letture ≥ 10) e i microRNA specifici condivisi in più di un campione sono mostrati nel diagramma di Venn. Tutte le letture non elaborate e normalizzate sono mostrate nel file supplementare 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Epitopo anticorpale</td>
			<td>Fattore di diluizione dell'anticorpo </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD9</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD63</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD81</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topo Anti-Flottiglia 1</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-TSG101</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Calnexin</td>
			<td>1:10 000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anticorpo secondario anti-topo</td>
			<td>1:3000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Epitopi anticorpali utilizzati per la caratterizzazione delle BDsEV e dei rispettivi fattori di diluizione. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Campione</td>
			<td>Concentrazione di miRNA (ng/μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>8.76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>3.24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>5.33</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Dati di quantificazione dell'RNA isolato.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Campione</td>
			<td>Sequenze allineate</td>
			<td>MiRNA mappato</td>
			<td>Percentuale (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Campione di controllo 1</td>
			<td>1 444 665</td>
			<td>1 133 437</td>
			<td>78.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Campione di controllo 2</td>
			<td>442 808</td>
			<td>381 631</td>
			<td>86.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Campione di controllo 3</td>
			<td>2 024 828</td>
			<td>1 983 726</td>
			<td>97.97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nella media</td>
			<td>1 304 100.33</td>
			<td>1 166 264.67</td>
			<td>89.43</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 3: Quantità di sequenze di miRNA allineate e mappate con successo. 
File supplementare 1: Dati supplementari dell'analisi del western blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%201.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: Dati di controllo NTA supplementari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%202.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 3: Conteggi delle letture grezze e normalizzate dell'analisi dell'espressione dei miRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%203.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 4: Dati supplementari sulla concentrazione proteica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%204.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Sfruttare il potere dei carichi di microRNA in piccole vescicole extracellulari rilasciate da sezioni di cervello umano appena congelate 

Small extracellular vesicles (sEVs) are crucial mediators of cell-cell communication, transporting diverse cargoes like proteins, lipids, and nucleic ...

harnessing-power-microrna-cargoes-small-extracellular-vesicles

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Il profilo dell'espressione dell'RNA in regioni cerebrali murine discrete richiede una strategia di raccolta dei tessuti precisa e ripetibile. Viene qui descritto un protocollo che utilizza sia il sezionamento coronale del cervello sia la microdissezione assistita da corer tissutale. Il rendimento e la qualità dell'RNA totale ottenuti dai campioni risultanti confermano l'utilità del metodo delineato.

Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica

I microRNA hanno un ruolo significativo nella struttura del cervello e la funzione. Qui si descrive un metodo per far rispettare miRNA ippocampale iper-espressione utilizzando l'iniezione stereotassica di lentivirus ingegnerizzati miRNA che esprimono. Questo approccio può servire come un modo relativamente rapido per valutare...

Iniezione stereotassica di microRNA-esprimono lentivirus al mouse Hippocampus CA1 regione e valutazione dei risultati Behavioral

Ci viene descritto come utilizzare la cattura microdissezione laser (LCM) per ottenere popolazioni arricchite di neuroni ippocampali o neuroni singoli da sezioni congelate di cervello di ratto feriti per la successiva analisi di espressione genica mediante real time PCR quantitativa e / o dell'intero genoma microarray.

Laser Microdissezione Cattura di popolazioni Arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico

Descriviamo un protocollo di PCR in tempo reale al profilo microRNA nel fluido cerebrospinale (CSF). Con l'eccezione di protocolli di estrazione di RNA, la procedura può essere estesa a RNA estratto da altri fluidi corporei, cellule coltivate, ei campioni di tessuto.

Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

I microRNA svolgono ruoli cruciali nel cervello e sono potenziali bersagli per la modellazione della neurodegenerazione. Tuttavia, perturbare i livelli di miRNA è difficile a causa della breve lunghezza dei miRNA e dell'inaccessibilità del tessuto cerebrale. Questo video presenta un metodo per la progettazione di antagomir e la somministrazione di antagomir specifici per il cervello utilizzando un neuropeptide nei topi.

Una alternativa semplice per iniezione stereotassica per Brain Knockdown specifico miRNA

Il presente protocollo descrive una tecnica di infusione di microchirurgia del topo, che eroga efficacemente sostanze direttamente nel cervello attraverso l'arteria carotide interna.

Tecnica mouse Microchirurgia infusione per Targeted Sostanza consegna nel sistema nervoso centrale via Carotide interna

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro su come combinare artificiale microRNA-mediata RNA interference con optogenetica per stimolare specificamente i boutons presinaptici con ridotta espressione dei geni selettivi all'interno di circuiti neuronali intatti.

Combinando optogenetica con microRNA artificiali per caratterizzare gli effetti del Gene atterramento su funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatto

Questo protocollo viene illustrato come purificare i microRNA extracellulari da terreni di coltura cellulare per piccoli RNA libreria costruzione e sequenziamento di nuova generazione. Vari punti di controllo di controllo di qualità sono descritti per permettere ai lettori di capire cosa aspettarsi quando si lavora con campioni di ingresso bassi come exRNAs.

Isolare, sequenziamento e analisi dei microRNA extracellulari dalle cellule staminali mesenchimali umane

Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Questa procedura descrive la raccolta di regioni cerebrali congelate discrete per ottenere proteine e RNA di alta qualità utilizzando strumenti economici e comunemente disponibili.

Raccolta di regioni cerebrali del roditore congelato per analisi a valle

Qui, descriviamo un sistema di nucleofecazione progettato per migliorare l'efficienza del rilascio genico in cellule staminali neurali espanse (NSC) isolate dalla zona subventricolare murina adulta. I risultati dimostrano che questo metodo migliora significativamente la perturbazione genica nelle NSC, superando l'efficacia dei protocolli di trasfezione tradizionali e migliorando il tasso di sopravvivenza cellulare.

Isolamento, espansione e nucleofezione di cellule staminali neurali dalla zona subventricolare murina adulta

Scopri un metodo efficiente per estrarre vescicole extracellulari da tessuto cerebrale umano congelato e analizzare il carico di microRNA. Questo protocollo riproducibile facilita l'identificazione di biomarcatori per la diagnosi precoce di demenze.

Sfruttare il potere dei carichi di microRNA in piccole vescicole extracellulari rilasciate da sezioni di cervello umano appena congelate (Video) | JoVE Journal

Sfruttare il potere dei carichi di microRNA in piccole vescicole extracellulari rilasciate da sezioni di cervello umano appena congelate

Esplora altri video