Name: Imaging dal vivo esteso di nicchie di cellule staminali germinali femmina di Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Impara l'imaging dal vivo esteso delle cellule staminali germinali in Drosophila melanogaster per studiare la dinamica dello spettrosoma durante il ciclo cellulare. Questo metodo consente di osservare la divisione asimmetrica in condizioni fisiologiche.

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Ringraziamo Acaimo González Reyes e María Olmedo López per gli utili commenti sul manoscritto. Questo studio è stato supportato da PID2021-125480NB-I00 (H. S-G), "Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor" della Junta de Andalucía (J. G-M), "Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos" del VI e VII PPIT-Università di Siviglia (P. R-R) e "Contrato de Acceso de I+D+i" del VI PPIT-Università di Siviglia (P. R-R). Estendiamo i nostri ringraziamenti alla Company of Biologists Ltd per aver gentilmente fornito i diritti di condivisione delle immagini adattate dalla pubblicazione originale (doi:10.1242/DEV.199716).

NOTA: Il passaggio 1.4 deve essere fatto con almeno 2 giorni di anticipo. I passaggi 2.1 e 2.2 possono essere eseguiti con 1 giorno di anticipo.
1. Configurazione pre-sperimentale I
<ol>
	<li>Preparare 100 μL di aliquote di miscela di antibiotici streptomicina/penicillina (10.000 U/mL di penicilina e 10 mg/mL di streptomicina) e conservare a -20 °C fino al momento dell'uso.</li>
	<li>Preparare 15 mL delle seguenti soluzioni utilizzando acqua pura sterilizzata in autoclave, conservarle a 4 °C e utilizzarle entro un mese: Bicarbonato di sodio (NaHCO3) 0,1 M pH 8,0 e 0,1% Tween 20.</li>
	<li>Preparare il seguente terreno di coltura e la soluzione in una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni. Utilizzare puntali e tubi filtranti sterilizzati.
	<ol>
		<li>Preparare 2 mL di aliquote di siero fetale bovino (FBS) non diluito e conservare a -20 °C fino all'uso in condizioni asettiche.</li>
		<li>Preparare il terreno Drosophila di Schneider integrato con il 15% di FBS e lo 0,6% di mix di antibiotici streptomicina/penicillina. Preparare 7 mL di aliquote e conservare a 4 °C. Un'aliquota è sufficiente per due piastre MatTek (vedere paragrafo 2).
		<ol>
			<li>Preparare la soluzione di Ringer (128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 35,5 mM Saccarosio, 5 mM Hepes in acqua pura autoclavata; pH 6,9). Preparare 1 mL di aliquote e conservare a -20 °C fino al momento dell'uso.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Raccogliere mosche di 1-2 giorni che esprimono costitutivamente e ubiquitariamente la proteina Par-1 fusa a GFP (linea poli-Ubiquitina-mGFP6::p ar-1) in un nuovo tubo con cibo per mosche integrato con lievito in polvere. Coltivarli per 2 giorni a 25 °C in un'incubatrice prima della dissezione. 
	NOTA: Questo passaggio può essere eseguito con qualsiasi reporter di interesse con tag fluorescenti.</li>
</ol>
2. Rivestimento e preparazione della lastra di fondo in vetro
<ol>
	<li>Posizionare una goccia da 3 μL di uno specifico adesivo Cell-Tak (d'ora in poi denominato adesivo per cellule e tessuti) al centro del vetrino coprioggetti di una lastra rivestita di poli-D-lisina da 35 mm (piatto con fondo in vetro, vedere Tabella dei materiali) senza stendere manualmente. Utilizzare puntali sterili. 
	NOTA: L'adesivo per cellule e tessuti deve essere conservato a 4 °C. Nel caso di esperimenti con due condizioni genetiche (tipicamente, condizioni di controllo e condizioni mutanti), posizionare due gocce individuali e ben separate di adesivo nella stessa lastra di fondo di vetro. Ciò garantirà che entrambi i background genetici siano ripresi nelle stesse condizioni.</li>
	<li>Subito dopo, aggiungere con cautela un volume uguale (3 μl in questa configurazione del protocollo) di 0,1 M NaHCO3 pH 8,0 nella goccia adesiva da 3 μl come raccomandato dal produttore e miscelare mediante pipettaggio.</li>
	<li>Per una completa evaporazione, incubare la piastra a temperatura ambiente (RT) per 20 minuti e poi conservare a 4 °C per una notte per essere utilizzata il giorno successivo. In alternativa, incubare la piastra preparata a 37 °C per 25 minuti fino alla completa evaporazione e procedere direttamente alla fase successiva. In entrambi i casi, mantenere la piastra con il suo coperchio. Utilizzare punte sterili.</li>
	<li>Lasciare che il piatto con fondo in vetro preparato raggiunga RT posizionandolo sul banco per 15-20 minuti prima dell'uso.</li>
	<li>Lavare accuratamente 3 volte il piatto preparato. Evitare di toccare e disturbare gli strati adesivi. Ad ogni lavaggio, aggiungere 6 μL di acqua pura autoclavata e quindi rimuovere l'acqua utilizzando una punta pulita per ciascuno dei tre lavaggi per eliminare i residui della soluzione di NaHCO3.</li>
	<li>Consentire la completa evaporazione dell'acqua posizionando la piastra pulita e preparata a RT mentre seziona per 5-10 minuti con il coperchio per evitare particelle di polvere.</li>
</ol>
3. Dissezione ovarica di Drosophila e isolamento e montaggio dell'ovaio
NOTA: La dissezione ovarica viene eseguita nella soluzione di Ringer (invece del terreno di Schneider) senza FBS per prevenire la presenza di proteine che potrebbero interferire con l'adesione del tessuto del campione all'adesivo.
<ol>
	<li>Prima di iniziare, pulire una capsula di dissezione a tre pozzetti, una pinza e gli aghi di dissezione con etanolo al 70%.</li>
	<li>Aggiungere un volume sufficiente (~200 μL) della soluzione di Ringer in ciascuno dei tre pozzetti.</li>
	<li>Sezionare le ovaie di 5 femmine alimentate con lievito in 200 μL di soluzione di Ringer nel primo pozzetto con l'aiuto di due paia di pinze seguendo le procedure standard10,11. Afferra la femmina di Drosophila all'intersezione tra il torace e l'addome con una delle pinze. Quindi, strappare delicatamente la cuticola nella parte posteriore dell'addome e tirare la cuticola dell'addome fino a quando le due ovaie non sono esposte.</li>
	<li>Trasferire le ovaie sezionate nel secondo pozzetto per ridurre la contaminazione con resti di altri tessuti o detriti derivanti dalla dissezione.</li>
	<li>Rimuovere la guaina muscolare di 15-20 ovarioli con l'aiuto di uno stereomicroscopio (zoom 8X-13,5X) con illuminazione a diodi emettitori di luce (LED) e pinze a punta fine. Usa un paio di pinze per ancorare l'intero corpo dell'ovaio e usa il secondo per afferrare dolcemente una camera dell'uovo in fase avanzata e allungare delicatamente fino a quando il muscolo non si rompe e rimane indietro. 
	NOTA: È essenziale evitare danni alla germaria semplicemente riducendo il contatto con questa parte delle ovaie. Rimuovere le camere delle uova più vecchie degli stadi 8-9.</li>
	<li>Trasferire uno ad uno i 15-20 ovarioli privi di guaina muscolare utilizzando la pinza al terzo pozzetto contenente 200 μL di terreno di Ringer.</li>
	<li>Pre-inumidire un puntale da 20-200 μl con lo 0,1% di Tween 20 mediante pipettaggio. In questo modo si evita l'adesione degli ovarioli alle pareti plastiche della punta.</li>
	<li>Trasferire 6 μl di soluzione di Ringer contenente gli ovarioli privi di guaina muscolare utilizzando una punta pre-bagnata sulla piastra adesiva preparata (mantenuta a RT). 
	NOTA: Evitare ogni contatto tra la punta e lo strato adesivo per evitare il distacco della germaria dopo la deposizione dell'ovariolo (passaggio successivo). Circa il 30% dei germari non aderisce come previsto.</li>
	<li>Per garantire che gli ovarioli trasferiti aderiscano alla superficie adesiva, premerli con cautela fino al fondo della goccia di Ringer fino a quando non entrano in contatto con la superficie adesiva utilizzando un ago da dissezione o una pinza. 
	NOTA: Non cercare di riorganizzare gli ovarioli una volta che si sono depositati.</li>
	<li>Riempire accuratamente la piastra MatTek con 3 mL di terreno di Schneider integrato con il 15% di FBS e lo 0,6% di miscela antibiotica streptomicina/penicillina (fase 1.3). Per evitare il distacco degli ovarioli, aggiungere lentamente 1 mL alla volta attorno al bordo esterno della piastra.</li>
	<li>Trasportare la piastra contenente gli ovarioli privi di guaina muscolare su una superficie piana fino alla stazione del microscopio.</li>
</ol>
4. Imaging dal vivo con un microscopio confocale
<ol>
	<li>Posizionare la piastra sull'obiettivo 63x di un microscopio a disco rotante o di un microscopio confocale (è possibile utilizzare un'attrezzatura simile) e mettere a fuoco il campione. Seleziona il piano z centrale per ogni germario.</li>
	<li>Configura i seguenti parametri sperimentali: tipo di acquisizione: time-lapse 3D, regola la potenza del laser di 70/100, lunghezza d'onda di eccitazione: 488 nm, intervallo dello z-stack: 30 μm e distanza tra gli Z-stack: 1,2 μm, durata: 17 h, intervallo tra i punti temporali: ogni 10 minuti.</li>
	<li>Se disponibile, utilizzando un'opzione multiposizione, ridefinire le coordinate XY dei campioni e selezionare un piano Z al centro di ciascun germario, poiché le pile Z saranno centrate in questa posizione. Inizia l'acquisizione. 
	NOTA: Poiché la larghezza normale di un germarium è di 30 μm, ogni Z-stack sarà composto da ~25-27 sezioni. A seconda della confocale, è possibile visualizzare almeno 25 germarie entro intervalli di 10 minuti. Normalmente, vengono utilizzati obiettivi 40x/1,30 NA o 63x/1,40 NA a immersione in olio, corretti per planapo.</li>
	<li>Analizza le immagini nel tempo e sull'asse Z per visualizzare cambiamenti specifici nella morfologia dello spettrosoma utilizzando il software Imaris o ImageJ (Fiji) 12,13. Vengono visualizzati i tempi specifici della loro osservazione (Figura 1B'). Per montare i filmati, selezionare manualmente il miglior piano Z in ogni momento.</li>
</ol>

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

<ol><li>Li, L., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+niche%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cell niche: structure and function.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 605-631 (2005).</li>
<li>Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+physiological+control+of+germline+stem+cell+lineages+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Local and physiological control of germline stem cell lineages in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 213 (1), e234(2019).</li>
<li>Eliazer, S., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+niche%3A+studies+from+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).</li>
<li>Rojas-Ríos, P., Guerrero, I., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+delivery+of+Hedgehog+regulates+the+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+to+maintain+germline+stem+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated delivery of Hedgehog regulates the expression of bone morphogenetic proteins to maintain germline stem cells in Drosophila.</a> PLoS Biol. 10 (4), e1001298(2012).</li>
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<li>Huynh, J. R., Shulman, J. M., Benton, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-1+is+required+for+the+maintenance+of+oocyte+fate+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-1 is required for the maintenance of oocyte fate in Drosophila.</a> Development. 128 (7), 1201-1210 (2001).</li>
<li>Villa-Fombuena, G., Lobo-Pecellín, M., Marín-Menguiano, M., Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+ovarian+niche+shows+spectrosome+and+centrosome+dynamics+during+asymmetric+germline+stem+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila ovarian niche shows spectrosome and centrosome dynamics during asymmetric germline stem cell division.</a> Development (Cambridge). 148 (18), dev199716(2021).</li>
<li>De Cuevas, M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+Drosophila+fusome+and+its+implications+for+oocyte+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the Drosophila fusome and its implications for oocyte specification.</a> Development. 125 (15), 2781-2789 (1998).</li>
<li>Wong Li, C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Drosophila ovaries.</a> J Vis Exp. (1), 52(2006).</li>
<li>Merkle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+fixation%2C+and+standard+staining+of+adult+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissection, fixation, and standard staining of adult Drosophila ovaries.</a> Methods Mol Biol. 2626, 49-68 (2023).</li>
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<li>Gärthner, S. M. K., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts%3A+dissection%2C+imaging%2C+and+pharmacological+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> J Vis Exp. 91, e51868(2014).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Qui presentiamo un protocollo per monitorare la nicchia GSC di Drosophila melanogaster per un periodo di tempo prolungato, fino a 16 ore. La maggior parte dei protocolli per filmare i processi biologici di Drosophila ex vivo si concentrano su finestre temporali più brevi e si possono trovare molteplici esempi per i dischi alari immaginali 15,16,17, le gonadi embrionali 18,19 o le ovaie 20,21,22,23. Certamente, la durata dell'acquisizione dell'immagine dipende dal processo di sviluppo in esame. Mentre gli eventi transitori possono verificarsi in un intervallo che può variare da millisecondi a secondi a seconda del tipo di cellula e delle condizioni fisiologiche24, altri processi, come la divisione cellulare, possono richiedere ore o giorni di riprese per essere osservabili. In particolare, il ciclo cellulare delle GSC femmine di Drosophila richiede circa 12-14 ore per essere completato25. In Villa-Fombuena et al. (2021)8, la stima della durata del ciclo completo è stata di 15,5 ore, come determinato dallo studio dei cambiamenti nella morfologia dello spettrosoma. La combinazione di questo metodo di imaging con marcatori di cromatina e/o la tecnologia Fly-FUCCI26 ha mostrato che una GSC tipicamente divisa ogni 15,5 ore e che la durata media delle fasi del ciclo cellulare era: M (forma rotonda, 22 min), G1 (forma rotonda G1, forme Plug e Bar, 3,45 ore), S (forma di fusione, 43 min) e G2 (fusione, Punto esclamativo e forme rotonde, 10,5 ore). I dati grezzi riguardanti la durata delle fasi del ciclo cellulare sono mostrati in Villa-Fombuena et al.8. Queste osservazioni erano coerenti con studi precedenti che utilizzavano l'imaging fisso per analizzare il ciclo cellulare delle GSC e la morfologia dei fusomi25,27,28. Inoltre, questo metodo in vivo potrebbe aiutare a decifrare le conseguenze a valle della divisione anomala delle GSC e/o della dinamica spettrosomica nella selezione degli ovociti a valle, poiché il fosomale svolge un ruolo importante in questi eventi. Inoltre, questo protocollo può essere applicato per analizzare il tasso di divisione GSC in mutanti consolidati o nuovi.
L'acquisizione continua di immagini per lunghe ore implica una serie di criticità da considerare, principalmente il mantenimento dell'integrità del tessuto e della sua funzionalità e, la conservazione della fluorescenza del campione. Il mantenimento delle corrette condizioni ambientali delle celle di nicchia è essenziale per evitare malfunzionamenti, stress, arresto del ciclo cellulare o morte cellulare. Nelle condizioni di questo studio, le GSC possono entrare in mitosi, un passaggio critico per indicare la salute dei tessuti, anche dopo 12 ore o più durante le riprese. Pertanto, supponiamo che i germari coltivati mantengano la loro integrità e funzionalità per la maggior parte del tempo di imaging. Allo stesso modo, a causa della nuova produzione di materiale GFP:Par-1 (vedi Villa-Fombuena et al. 2021)8 durante tutto il ciclo cellulare, e poiché riduciamo l'acquisizione dell'immagine a una sola volta ogni 10 minuti, anche i punti temporali più vicini alla fine dei filmati conservano un segnale sufficiente per consentirne l'analisi. In ogni caso, lo sbiancamento dei campioni può essere potenzialmente corretto da plugin come la correzione del decolorante13.
Per imitare un ambiente adeguato ex vivo, i tessuti degli insetti possono essere mantenuti utilizzando il mezzo di Schneider per un certo numero di ore durante le riprese con un'integrazione specifica. È importante sottolineare che questo protocollo non utilizza fattori di crescita o estratti di mosca diversi da FBS. Uno studio precedente ha dimostrato che molte GSC vengono normalmente arrestate in G2 ed entrano nella fase M da alti livelli di insulina25. Pertanto, non aggiungiamo insulina alle condizioni di coltura per evitare questa stimolazione anomala del ciclo cellulare GSC. L'aggiunta di FBS al mezzo di dissezione può anche ridurre la possibilità che le camere delle uova si attacchino alla punta della pipetta o al piatto di vetro durante il trasferimento dell'ovariolo21. Infine, l'uso di antibiotici è appropriato per film estesi per evitare la proliferazione batterica e/o fungina. La crescita eccessiva di microrganismi nelle piastre di coltura può alterare l'omeostasi del tessuto e, quindi, influenzare la divisione cellulare. In questo protocollo, il terreno contiene un mix di antibiotici (tipicamente integrati all'1% (100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina). Allo stesso modo, lunghe incubazioni possono influenzare l'efficienza degli antibiotici e la sostituzione del terreno potrebbe essere presa in considerazione per prevenire il decadimento degli antibiotici.
La Drosophila germaria è circondata da una guaina muscolare tubulare che è necessario rimuovere per prevenire i movimenti peristaltici, rotatori e di contrazione tipici di questo tessuto29,30. Pertanto, la rimozione di questa guaina muscolare migliora l'osservazione dei segnali reporter, consente l'uso di configurazioni di impostazione confocali per ridurre al minimo lo sbiancamento del segnale e il fotodanneggiamento e consente immagini ad alta risoluzione temporale. Al rovescio della medaglia, il contributo della guaina muscolare all'omeostasi del tessuto è ancora sconosciuto. Pertanto, la sua rimozione può in qualche modo influire sul normale funzionamento della nicchia GSC. Un altro svantaggio del sistema è che la germaria può staccarsi dall'adesivo durante la ripresa e spostarsi nel mezzo circostante. Pertanto, le immagini possono spostarsi all'interno di punti temporali o anche durante l'acquisizione della serie z data. In questo caso, è possibile utilizzare diversi plug-in per correggere il movimento del campione in ImageJ, come i metodi di registrazione12.
In sintesi, abbiamo ideato un metodo per acquisire filmati estesi di germaria dal vivo. Sebbene questo metodo abbia permesso una definizione dettagliata del ciclo cellulare GSC e di come la dinamica dello spettrosoma sia correlata con le diverse fasi del ciclo cellulare GSC, siamo consapevoli di alcune delle limitazioni inerenti al nostro protocollo. Innanzitutto, l'acquisizione delle immagini avviene in un mezzo artificiale in cui le condizioni ambientali non riassumono esattamente le condizioni in vivo . Tuttavia, poiché abbiamo ottenuto risultati simili per quanto riguarda la morfologia dello spettrosoma durante le diverse fasi del ciclo cellulare rispetto a quelli riportati da altri autori utilizzando il tessuto fisso31, riteniamo che questo protocollo riassuma ampiamente le condizioni in vivo . In secondo luogo, mentre l'integrità e la funzionalità dei tessuti sembrano non essere influenzate dalle colture di 16 ore, non abbiamo valutato attentamente questo aspetto. Idealmente, si potrebbe trapiantare la germaria filmata in un addome femminile e valutare se può produrre nuove camere per le uova come fanno i germari di controllo32. Il metodo di imaging dal vivo utilizzato in questo studio è uno strumento prezioso per l'analisi della divisione asimmetrica delle GSC, in particolare per la biologia ovarica di Drosophila in generale. Inoltre, questo approccio è particolarmente adatto per studi farmacologici di composti chimici, fattori di crescita o nutrienti, in quanto possono essere integrati direttamente nei terreni di coltura. Inoltre, possiamo posizionare campioni sperimentali e di controllo nella stessa piastra, riducendo al minimo le variazioni tecniche all'interno degli esperimenti.

L'imaging dal vivo dei processi biologici è fondamentale per ottenere prove sperimentali dirette. La combinazione di microscopia confocale avanzata e l'ottimizzazione delle metodologie consente l'esplorazione di molteplici eventi biologici con elevata precisione. L'ottimizzazione delle fasi di protocolli come la manipolazione e la dissezione dei tessuti, la preparazione e la conservazione dei campioni e le impostazioni di acquisizione al microscopio è fondamentale per massimizzare l'affidabilità e la robustezza dei risultati ottenuti. Qui, presentiamo un protocollo per monitorare i campioni per l'imaging esteso, che è particolarmente focalizzato sulle ovaie di Drosophila melanogaster. L'ovaio di Drosophila melanogaster è un eccellente sistema modello per l'analisi di un'ampia gamma di processi di sviluppo. Tra i tanti, questo organo riproduttivo del moscerino della frutta Drosophila melanogaster contiene una nicchia di cellule staminali adulte molto ben definita. Questa nicchia GSC sostiene lo sviluppo dei gameti femminili durante l'età adulta. Le ovaie di Drosophila sono composte da circa 18 ovarioli, dove si sviluppano le camere delle uova nel germario. Nella punta di ogni germario, 2-4 GSC sono mantenute in una nicchia cellulare somatica formata principalmente da un filamento terminale di 8-10 cellule, una rosetta di 5-8 cellule di tappo e 2-3 cellule di scorta anteriori (Figura 1A). Questa nicchia somatica fornisce alle GSC segnali essenziali e supporto fisico per mantenere la loro staminalità, controllare la proliferazione e prevenire la differenziazione1,2,3,4,5.
Le GSC normalmente si dividono in modo asimmetrico per generare una nuova cellula staminale che mantiene il contatto con la nicchia somatica e una cellula figlia, il cistoblasto (CB), che perde il contatto diretto con le cellule somatiche e si differenzia. Le GSC e i CB contengono un organello citoplasmatico altamente dinamico, lo spettrosoma, la cui funzione principale è il corretto orientamento del fuso mitotico durante la mitosi6. Il CB si divide 4 volte con citocinesi incompleta per sviluppare cisti a 16 cellule, dove una delle cellule germinali si specifica nell'ovocita e le altre 15 cellule diventano cellule nutrici. Lo spettrosoma CB cresce in una struttura ramificata chiamata fusoma che collega le cellule germinali interconnesse a 16 cellule. Lo spettrosoma è arricchito in piccole vescicole e proteine scheletriche come la serina-treonina chinasi Par-1 e il componente di membrana Hu-li tai shao (Hts)7. Durante il ciclo cellulare GSC, lo spettrosoma cresce con l'aggiunta di nuovo materiale e cambia la sua forma, consentendo l'identificazione delle fasi G1, S, G2 e M (Figura 1B)8,9.
Abbiamo recentemente implementato un metodo di coltura ex vivo del germarium di Drosophila che consente l'imaging di GSC vive per un massimo di 16 ore. Poiché queste cellule si dividono in media una volta ogni 15,5 ore8, questo metodo consente di filmare grandi porzioni del ciclo cellulare GSC. Pertanto, in combinazione con altri strumenti, il nostro metodo di coltura ha permesso la descrizione della morfologia dello spettrosoma durante il ciclo cellulare GSC e l'analisi della durata delle diverse fasi del ciclo cellulare in vivo8 (Figura 1C). Qui, forniamo un protocollo dettagliato di questo metodo di imaging dal vivo esteso supportato da un video guidato passo dopo passo che descrive la metodologia (Figura 2).

<table><tbody><tr><td>Piastra di vetro a 9 pozzetti</td><td>Corning&nbsp;</td><td>7220-85</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td>CaCl2&middot; 2H2O; Per preparare la soluzione di Ringer</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354240</td><td>Adesivo per cellule e tessuti utilizzato per fissare cellule o sezioni di tessuto a molti tipi di superfici, tra cui plastica, vetro, metallo, polimero FEP e materiali biologici.</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forcipe</td><td>Finescience</td><td>11252-20</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Dumont #55 Pincipe</td><td>Finescience</td><td>11255-20</td><td>Dimensioni 0,05 mm x 0,02 mm e lunghezza 11 cm</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td>Qualificato, inattivato termicamente, approvato dall'UE, Sud America Origine&nbsp;</td></tr><tr><td>Piatti con fondo in vetro</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>Piatto da 35 mm, n. 1.5 Vetrino coprioggetti, diametro vetro 10 mm,&nbsp; HEPES</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td> rivestito in poli-D-lisina <td>Per preparare la soluzione di Ringer</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td>MgCl2; Per preparare la soluzione di Ringer</td></tr><tr><td>Porta aghi</td><td>Roboz&nbsp;</td><td>RS-6061</td><td>Leggero, manico cavo in acciaio inox; 4 3/4" lungo.</td></tr><tr><td>Binocolo Nikon SMZ18</td><td>Nikon</td><td></td><td>https://www.microscope. healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific 15140122</td><td></td><td>10.000 U/mL</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>KCl; Per preparare la soluzione di</td></tr><tr><td>Ringer Drosophila Medium</td><td>Biowest</td> di Schneider<td>L0207</td><td>Terreno di coltura cellulare per cellule di insetti</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8875&nbsp;</td><td>NaHCO3; 99,5%, polvere</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl; Per preparare la soluzione di Ringer</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>&ge; 99,5% (GC); Per preparare la soluzione di Ringer</td></tr><tr><td>Ago da dissezione al tungsteno</td><td>Roboz&nbsp;</td><td>RS-6064</td><td>0,25 mm, Ultra Fine, Punta da 1 micron (Pk 10)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>per biologia molecolare, liquido viscoso</td></tr><tr><td>Lievito in polvere</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51475</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

imaging dal vivo esteso di nicchie di cellule staminali germinali femmina di drosophila melanogaster

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

I metodi di imaging dal vivo consentono l'analisi dei processi cellulari dinamici in dettaglio e in tempo reale. L'ovaio di Drosophila rappresenta un modello eccellente per esplorare le dinamiche di una miriade di processi di sviluppo, come la divisione cellulare, la staminalità, la differenziazione, la migrazione, l'apoptosi, l'autofagia, l'adesione cellulare, ecc., nel tempo. Recentemente, abbiamo implementato una coltura ex vivo estesa e l'imaging dal vivo della nicchia GSC della femmina di Drosophila. Utilizzando come esempio una linea di Drosophila che ospita un transgene GFP::P ar-1, questo metodo consente la visualizzazione della divisione asimmetrica delle GSC all'interno della loro nicchia e la descrizione dei cambiamenti nella morfologia dello spettrosoma lungo il ciclo cellulare. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la coltura ex vivo di Drosophila germaria, che consente una visualizzazione prolungata della nicchia delle GSC femminili. È importante sottolineare che questo protocollo è ampiamente applicabile alle GSC di imaging dal vivo con più proteine di interesse marcate in fluorescenza che sono disponibili nei centri di stoccaggio e/o nella comunità di ricerca sulla Drosophila.

Con questo protocollo esteso di imaging in tempo reale, possiamo registrare la mitosi asimmetrica delle cellule staminali germinali femminili (GSC) all'interno del loro nicchio senza evidenti disturbi biologici. A tal fine, utilizziamo germari che esprimono ubiquitariamente la proteina GFP::Par-1, la quale permette di discriminare tra cinque morfologie distinte dello spettrosoma durante il ciclo cellulare delle GSC: rotondo, tappo, barra, fusione e punto esclamativo (Figura 1B,C). In una descrizione più dettagliata, abbiamo osservato che il forte segnale GFP::Par-1 dello spettrosoma rotondo in fase G2 (Figura 1C, pannello a) si riduce drasticamente durante le fasi G2-M-G1. In particolare, l'uso di questa linea transgenica consente anche la visualizzazione dell'ingresso in mitosi delle GSC, poiché la maggior parte della GFP::Par-1 abbandona lo spettrosoma e riempie il citoplasma durante la profase iniziale (Figura 1C, pannello b). Inoltre, la GFP::Par-1 citoplasmatica permette la rilevazione precisa del passaggio di permeabilizzazione dell'involucro nucleare (NEP)8,14, momento in cui il segnale GFP entra nel nucleoplasma (Figura 1C, pannello b). Dopo la mitosi e la riformazione dell'involucro nucleare, il segnale GFP::Par-1 viene gradualmente recuperato nello spettrosoma rotondo in fase G1 (Figura 1C, pannello c). L'aggiunta de novo di materiale GFP::Par-1 allo spettrosoma rotondo in fase G1 promuove la formazione delle morfologie spettrosomiali tappo (Figura 1C, pannello d), barra (Figura 1C, pannello e) e fusione (Figura 1C, pannello f). Infine, il marcatore GFP::Par-1 consente la visualizzazione dello spettrosoma a punto esclamativo (Figura 1C, pannello e), come conseguenza della formazione del corpo medio, una struttura proteica ricca di microtubuli che si forma durante la citocinesi in aggiunta all'anello contrattile di actomiosina.
<img alt="Fasi di differenziazione delle cellule staminali della linea germinale; morfologia dello spettrosoma; diagramma delle fasi del ciclo; microscopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Dinamica del ciclo dello spettrosoma in GSC vive. (A) Diagramma schematico dell'ambiente delle cellule staminali della linea germinale (GSC), composto da cellule del filamento terminale (TFC, in blu), la cellula di transizione (TC, in rosso), le cellule del cap (CpCs, in viola) e le cellule di accompagnamento (ECs, in grigio). Le GSC (in giallo) contengono un organulo caratteristico chiamato spettrosoma (in verde). Durante il ciclo cellulare delle GSC, lo spettrosoma passa da una forma sferica a una forma allungata e quindi torna a essere sferico. La GSC si divide per generare una cellula figlia, lo cistoblasto (CB, in arancione), che perde il contatto con l'ambiente e che contiene anch'esso uno spettrosoma sferico. Il CB si divide quattro volte consecutive e sincrone con citocinesi incompleta per produrre cisti di 2, 4, 8 e 16 cellule interconnesse dal fusoma. (B) Diagramma che rappresenta le diverse forme dello spettrosoma generate durante il ciclo cellulare. (B') Tempo previsto per l'osservazione delle morfologie dello spettrosoma. (C) Immagini a punti temporali di un filmato della durata di 17 h che mostra il segnale GFP::Par-1 nell'ambiente delle GSC. Il tempo 0 min (0') corrisponde alla permeabilizzazione dell'involucro nucleare (NEP). Il pannello illustra cinque diverse morfologie dello spettrosoma (punti freccia bianchi e verdi): rotondo (sia in G2 che in G1; pannello a e c), tappo (pannello d), barra (pannello e), fusione (pannello f) e punto esclamativo (pannello e, punto freccia verde). L'ultima morfologia dello spettrosoma appartiene alla seconda GSC (linea tratteggiata verde) mostrata a 70'. Le GSC sono delimitate da linee tratteggiate gialle e verdi. I CB risultanti dalla divisione delle GSC sono delimitati da linee tratteggiate arancioni. Barra della scala: 10 µm. I pannelli A e B sono stati adattati con autorizzazione da Villa-Fombuena et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig01large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Diagramma di isolamento dell'ovariole di Drosophila; passaggi: preparazione MatTek, dissezione, acquisizione immagini; metodo biologico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Metodo di montaggio dell'adesivo Cell-Tak per l'acquisizione di immagini vitali prolungata dei germari di Drosophila. (1) Procedura passo dopo passo per preparare la piastra con fondo in vetro utilizzando l'adesivo. (2) Panoramica della dissezione dell'ovaio di Drosophila in soluzione di Ringer e della preparazione dell'ovariole singolo privo di muscolo. (3) Trasferire gli ovariolie privi della guaina muscolare nella piastra con fondo in vetro. (4) Riempire la piastra con fondo in vetro con mezzo di Schneider integrato. (5) Acquisire immagini dei germari per un periodo compreso tra 10 h e 16 h utilizzando un microscopio confocale invertito. Questa figura è stata adattata con autorizzazione da Villa-Fombuena et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig02large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per eseguire l'imaging dal vivo della divisione asimmetrica delle cellule staminali germinali (GSC) nella nicchia ovarica di Drosophila. Utilizziamo una linea transgenica che esprime ubiquitariamente una fusione di proteina fluorescente verde (GFP) della proteina spettrosoma Par-1.

Imaging dal vivo esteso di nicchie di cellule staminali germinali femmina di Drosophila melanogaster

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

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