Imaging dal vivo esteso di nicchie di cellule staminali germinali femmina di Drosophila melanogaster

Siamo interessati a scoprire nuovi meccanismi cellulari e molecolari che controllano la staminalità delle cellule. Il nostro obiettivo principale è quello di decifrare come le cellule staminali evitano la differenziazione nelle nicchie. Poiché stiamo lavorando in condizioni sperimentali, è essenziale preservare l'integrità dei tessuti per garantire che le GSC ricevano un comportamento fisiologico.

Il nostro protocollo mantiene una nicchia di GSC sana e funzionale che consente il monitoraggio delle GSC in divisione come sarebbero in vivo. L'uso dell'imaging a vita estesa ci permette di studiare l'intero ciclo cellulare delle GSC e la dinamica degli spettrosomi. In particolare, caratterizziamo con successo i cambiamenti dello spettrosoma durante il ciclo cellulare, un compito che in precedenza era difficile da ottenere con immagini fisse o periodi di imaging più brevi.

Saper eseguire principalmente esperimenti senza influenzarne la dinamica ci permette di esplorare come comunicano le cellule di nicchia. Vogliamo studiare i meccanismi regolatori dell'espressione genica e del metabolismo cellulare mediati dall'interazione diretta tra mRNA, enzimi metabolici nella biologia delle cellule staminali. Per iniziare, preparare aliquote da 100 microlitri della miscela antibiotica streptomicina penicillina a una concentrazione di 10.000 unità per millilitro.

Preparare tutti gli altri reagenti necessari per la procedura e conservarli in modo appropriato. Raccogli le mosche di uno o due giorni che esprimono la par uno espressa in modo ubiquitario e costitutivo fusa con GFP in un nuovo tubo. Coltiva le mosche per due giorni a 25 gradi Celsius in un'incubatrice prima della dissezione.

Posizionare una goccia da tre microlitri dell'adesivo specifico Cell-Tak al centro del vetrino coprioggetto di una lastra rivestita in poli-D-luccina da 35 millimetri. Aggiungere immediatamente un volume uguale di bicarbonato di sodio 0,1 molare con un pH di otto alla goccia adesiva da tre microlitri. Mescolare la soluzione con una pipetta.

Per una completa evaporazione, incubare la piastra con il coperchio a temperatura ambiente per 20 minuti. Quindi conservare la piastra a quattro gradi Celsius per una notte. Dopo aver scongelato la lastra il giorno successivo, lavarla tre volte con sei microlitri di acqua pura in autoclave accuratamente senza toccare e disturbare lo strato adesivo.

Lascia evaporare completamente l'acqua a temperatura ambiente per cinque-10 minuti. Per iniziare, alleva le mosche e prepara la piastra inferiore in vetro con il rivestimento. Quindi pulire una capsula di dissezione a tre pozzetti, una pinza e aghi di dissezione con etanolo al 70%.

Aggiungere circa 200 microlitri di soluzione di ringer a ciascuno dei tre pozzetti della capsula di dissezione. Usando il forcipe, afferra la femmina di Drosophila all'intersezione tra il torace e l'addome. Strappare delicatamente la cuticola nella parte posteriore dell'addome e tirarla indietro per esporre le ovaie.

Dopo aver sezionato le ovaie, trasferirle nel pozzetto successivo per ridurre la contaminazione con resti di tessuto o detriti della dissezione. Sotto uno stereomicroscopio con illuminazione a LED, utilizzare un paio di pinze sottili per ancorare l'intera ovaia e il secondo paio per afferrare una camera uovo in fase avanzata. Allungare delicatamente fino a quando la guaina muscolare non si rompe e rimane indietro.

Usando una pinza, trasferire le 15-20 ovaie libere da guaina muscolare una per una al terzo pozzetto contenente 200 microlitri di terreno ringer. Pre-bagnare una punta da 200 microlitri con lo 0,1% di Tween 20 per evitare che le ovaie si attacchino alla parete della punta. Trasferire sei microlitri di soluzione ringer contenente le ovaie prive di guaina muscolare utilizzando la punta pre-bagnata sulla piastra adesiva preparata a temperatura ambiente.

Utilizzando un ago da dissezione o una pinza, premere con cautela le ovaie sul fondo della goccia del ringer per garantire il contatto con la superficie adesiva. Successivamente, aggiungere tre millilitri di terreno di Schneider, integrato con il 15% di FBS e lo 0,6% di streptomicina e penicillina alla piastra MatTek. Trasportare la piastra contenente le ovaie prive di guaina muscolare su una superficie piana fino alla stazione del microscopio.

Posizionare la piastra sull'obiettivo 63x di un microscopio a disco rotante o di un microscopio confocale. Mettere a fuoco il campione e selezionare il piano Z centrale per ogni germanio. Per configurare i parametri sperimentali, impostare il tipo di acquisizione su 3D time lapse.

Regolare la potenza del laser al 70% del massimo. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione su 488 nanometri. L'intervallo dello stack Z è di 30 micrometri e la distanza tra gli stack Z di 1,2 micrometri.

Impostare l'intervallo tra i punti di tempo su ogni 10 minuti e la durata su 17 ore. Se disponibile, utilizzare l'opzione multiposizione per ridefinire l'XY dei campioni. Seleziona il piano Z al centro di ogni germarium in modo che le pile Z siano centrate in questa posizione e avvia l'acquisizione.

Analizza le immagini nel tempo e lungo l'asse Z per visualizzare i cambiamenti nella morfologia dello spettrosoma utilizzando il software Imaris o Image J. Per creare i filmati, selezionare manualmente il miglior piano Z in ogni momento. Il forte segnale GFP par one della zona dello spettro G2 rotondo è stato significativamente ridotto durante le fasi G2 MG1.

Durante la profase precoce la GFP par uno ha lasciato lo spettrosoma e ha riempito il citoplasma, indicando l'ingresso delle cellule staminali germinali nella mitosi. Dopo la mitosi e la riformazione dell'inviluppo nucleare, il segnale GFP par one si è gradualmente ripreso nel ciclo rotondo G1 Spectro. L'edizione Denovo di GFP par one allo spettrosoma rotondo G1 ha portato alla formazione di morfologie di spettrosomi a spina, a barra e a fusione.