Una piattaforma di array multi-elettrodo per la modellazione dell'epilessia utilizzando assembloidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti umane
27 settembre 2024
Questo protocollo mira a placcare stabilmente assembloidi fusi dorsale-ventrale su array multi-elettrodi per modellare l'epilessia in vitro.
Negli ultimi decenni, un'esplosione di scoperte genetiche ha identificato centinaia di geni che causano o sono associati all'epilessia. Tuttavia, i meccanismi patogenetici non sono così ben esplorati. Il nostro laboratorio studia come i cambiamenti genetici influenzano lo sviluppo precoce del cervello e provocano malformazioni cerebrali ed epilessia, una malattia debilitante caratterizzata da convulsioni croniche.
Le epilessie genetiche sono state tipicamente studiate utilizzando modelli animali, tra cui topi, zebrafish, drosofila e conigli. Le cellule staminali umane sono state recentemente utilizzate per modellare le epilessie genetiche man mano che le tecniche per differenziare le cellule staminali in tessuto neuronale sono avanzate. Con l'avvento degli organoidi cerebrali, è possibile ricapitolare gli aspetti strutturali dello sviluppo cerebrale.
Misurare l'attività elettrofisiologica e determinare i biomarcatori dell'attività correlata all'epilessia da organoidi e assembloidi cerebrali è impegnativo. In parte, questa tecnica è limitata perché gli organoidi cerebrali non possono avere convulsioni come può fare un animale intatto. Tuttavia, trovare differenze elettrofisiologiche in questo modello in vitro e le risposte ai trattamenti farmacologici può aiutare a determinare i meccanismi patologici e le risposte terapeutiche nelle epilessie genetiche.
L'attività elettrofisiologica può essere valutata utilizzando le tradizionali registrazioni di patch climbing, le registrazioni sul campo locale con elettrodi e tecniche ottiche come l'imaging del calcio e della tensione di memoria. L'utilizzo di registrazioni con array multielettrodo ha il vantaggio di essere in grado di lanciare due registrazioni nel tempo e di registrare da più posizioni di un assembloide contemporaneamente.
Panoramica
Questo protocollo descrive la piastratura stabile di assembloidi fusi dorso-ventrali su array multi-elettrodi (MEA) per modellare l'epilessia in vitro. Affronta le difficoltà nella misurazione dell'attività elettrofisiologica e nella comprensione dei meccanismi patologici delle epilessie genetiche mediante organoidi cerebrali derivati da cellule staminali umane.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Ricerca sull'epilessia
- Neurosviluppo
Sfondo
- Le scoperte di geni hanno identificato numerosi geni associati all'epilessia.
- I meccanismi patogenetici rimangono poco esplorati nonostante i progressi nei modelli.
- Le cellule staminali umane e gli organoidi cerebrali si sono affermati come modelli per lo studio delle epilessie genetiche.
- La misurazione dell'attività neuronale negli organoidi è limitata rispetto ai modelli animali integri.
Scopo dello studio
- Stabilire un protocollo per la semina stabile di assembloidi su MEA.
- Indagare le differenze elettrofisiologiche osservate nei modelli in vitro.
- Valutare le risposte ai trattamenti farmacologici nella modellizzazione delle epilessie genetiche.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di matrici multielettrodo (MEA) per registrazioni elettrofisiologiche.
- Modellizzazione mediante assembloidi fusi dorso-ventrali derivati da cellule staminali umane.
- Passaggi critici includono il pretrattamento della superficie della MEA, la preparazione delle pozzette e il posizionamento degli assembloidi.
- Osservazione della maturazione neuronale nel tempo con valutazioni dell'attività della rete.
Risultati principali
- È stata osservata una maggiore durata degli episodi di attività a raffica della rete con il maturare dei neuroni.
- L'attività cellulare e della rete è stata monitorata nel tempo, attenuandosi infine entro il giorno 125.
- La valutazione delle risposte ai farmaci potrebbe contribuire a svelare i meccanismi patologici dell'epilessia.
Conclusioni
- Questo studio fornisce un metodo solido per modellare l'epilessia in vitro utilizzando assembloidi su MEA.
- I risultati permettono indagini dettagliate sulla patologia e sulle risposte al trattamento delle epilessie genetiche.
- Le conoscenze acquisite potrebbero migliorare la comprensione dei meccanismi neurali associati all'epilessia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Gli assembloidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti umane piastrati su array multielettrodi (MEA) consentono misurazioni longitudinali e non distruttive dell'attività delle reti neuronali rilevanti per l'epilessia. Questa piattaforma colma il divario traduttivo tra la scoperta genetica e la comprensione meccanicistica, fornendo un sistema scalabile e specifico per l'uomo per l'interrogazione funzionale e la profilazione della risposta ai farmaci. L'approccio supporta una maggiore affidabilità predittiva nella validazione precoce dei bersagli e orienta decisioni di portafoglio basate sulla valutazione del rischio nello sviluppo di neuroterapie.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente la valutazione funzionale di varianti genetiche coinvolte nell'epilessia utilizzando circuiti neurali di origine umana.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico rivelando fenotipi a livello di rete e schemi di attività anomali.
- Facilita l'indagine basata su ipotesi sull'integrazione neuronale eccitatoria e inibitoria.
- Fornisce una piattaforma per valutare l'impatto di interventi candidati sulla dinamica della rete rilevante per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un saggio elettrofisiologico robusto e longitudinale per la quantificazione dell'attività della rete su periodi prolungati.
- Consente misurazioni riproducibili di potenziali di campo, potenziali d'azione e modelli di bursting in diversi assemblodi.
- Permette una preparazione standardizzata di sistemi neurali 3D complessi per lo screening di composti successivi.
- Facilita l'acquisizione scalabile e multiplex di dati per l'analisi comparativa delle risposte ai farmaci.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i fenotipi delle reti in vitro a biomarcatori rilevanti per la malattia nella ricerca sull'epilessia.
- Fornisce continuità dalla scoperta genetica alla validazione preclinica in un contesto specifico per l'uomo.
- Supporta l'avanzamento dei candidati neuroterapeutici con rischio calibrato sulla base di letture funzionali.
- Consente una valutazione meccanicistica degli interventi terapeutici in un sistema controllato e scalabile.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa piattaforma di assembloidi basata su MEA collega la fase iniziale della scoperta alla ricerca preclinica, consentendo la validazione funzionale delle target, lo sviluppo di saggi e l'allineamento di biomarcatori traslazionali nella modellizzazione dell'epilessia.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la riduzione del rischio meccanicistico quantificando gli effetti a livello di rete di perturbazioni genetiche o farmacologiche.
- Screening: Fornisce output elettrofisiologici quantitativi e riproducibili, adatti alla valutazione di composti e alla standardizzazione dei saggi.
- Analisi: Permette la misurazione longitudinale dell'attività di bursting della rete, della maturazione e della risposta ai farmaci per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Allinea i fenotipi in vitro ai meccanismi della malattia, supportando decisioni precliniche guidate da biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile e adattabile per modellare diverse regioni cerebrali e condizioni neurologiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sull'epilessia.
- Valore operativo: Standardizza saggi neurali complessi per garantire riproducibilità e scalabilità tra i diversi team di ricerca e sviluppo.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione dei progetti e l'efficienza nell'uso del capitale fornendo dati funzionali umani in fase precoce del processo.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione di asset neuroterapeutici in base a evidenze funzionali solide, adeguando il livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella differenziazione delle cellule staminali, nella coltura di organoidi e nell'allestimento di saggi elettrofisiologici.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per array multiplo di elettrodi e a infrastrutture analitiche per l'acquisizione di dati ad alto contenuto informativo.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di semina, manutenzione e analisi dei dati.
- È adattabile a organoidi specifici di diverse aree cerebrali, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione per diversi tipi di tessuto.
- La stabilità della coltura a lungo termine e delle registrazioni è fondamentale per studi longitudinali affidabili.
