Valutare motilità delle cellule staminali neurali L'utilizzo di un gel a base di Agarose dispositivo a microfluidi

Ciao, sono Kevin ha vinto. Sono uno studente di master in ingegneria presso il Biofluids Lab della Cornell University. E oggi parlerò dell'utilizzo di un dispositivo microfluidico basato su agros per studiare l'effetto del fattore di crescita epidermico EGF sulle cellule staminali neuro Maureen.

Il dispositivo è costituito fondamentalmente da tre canali microfluidici, ciascuno largo 150 micron. L'EGF viene pompato in uno dei canali laterali e il tampone viene pompato nell'altro canale laterale. Fondamentalmente imposta un gradiente chimico lineare statico attraverso il canale centrale.

Poiché la diffusione dell'EGF si diffonde facilmente attraverso l'agro gel, le cellule staminali del neurone vengono seminate nel canale centrale e l'andamento della loro migrazione viene monitorato attraverso un microscopio. Quindi i dispositivi erano fondamentalmente costituiti da uno strato superiore in plexiglass che ha tutti gli ingressi e le uscite per il collegamento al tubo. E sotto c'è una membrana in agro gel, che contiene quattro dispositivi di pattern.

Questo è circondato da un distanziatore PDMS, che garantisce uno spessore costante in tutto il dispositivo. Il PDMS e il gel si assemblano su un vetrino, rivestito con ect. Questo aiuta le celle ad aderire al vetrino.

Inoltre, la piastra in acciaio inossidabile viene utilizzata per montare l'intero dispositivo e noi Sam inseriamo il dispositivo insieme alle viti. La linea cellulare wild type è stata trasfettata con un vettore retrovirale per sovraesprimere il recettore EGF wild type e la linea cellulare delta è stata trasfettata con una versione mutata del recettore EGF che le consente di essere costitutivamente attiva senza il ligando EGF. Ok, quindi inizierò spiegando il processo di assemblaggio del nostro dispositivo micro fluidico.

Quindi ho posizionato per la prima volta il distanziatore PDMS attorno alle caratteristiche di rilievo dei micro canali in silicio nei nostri master. Quindi ora peserò 0,3 grammi di agro. Quindi ora porterò 10 mil di CO2 indipendenti e li aggiungerò agli agro.

su e giù per mescolare la polvere di aros con il mezzo indipendente dalla CO2. Ora siamo pronti per il microonde. Come puoi vedere ora, l'agros è ora liquefatto, ma ci sono ancora alcuni granuli rimasti.

Cercherò di farlo roteare per sciogliere il granulo ed eliminare le bolle d'aria. Quindi sto versando gli agro fusi sulle caratteristiche di rilievo del master in silicone e ora prenderò un vetrino sterile e lo posizionerò sopra il distanziatore PDMS. E l'ho messo ad angolo per cercare di forzare la maggior parte delle bolle d'aria nell'agro gel.

E ho applicato pressione e continuerò ad applicare pressione fino a quando il guscio agros non si solidifica. Quindi, dopo uno o due minuti, si è solidificato. Ora rimuoverò gli agro in eccesso dal vetrino.

Il passaggio successivo consiste nello sfilare delicatamente il vetrino e questo vetrino può essere smaltito. Ora cercherò di trasferire delicatamente il modello su un vetrino che ho precedentemente rivestito con fibronectina. Fondamentalmente uso questo foglio di plastica sterile per aiutarmi a sollevare gli agro del modello con il distanziatore PDMM MS e trasferirò gli agro del modello con i canali verso il basso verso il vetrino.

Ora che questo è saldamente sul vetrino, farò dei fori nei singoli serbatoi in modo che il collettore di plastica abbia accesso ai canali. Lo farò usando una piccola perforatrice metallica. Ora abbiamo finito di praticare i fori nel dispositivo.

Aggiungerò 500 microlitri di terreno indipendente dalla CO2 per evitare l'essiccazione dei micro canali e ora lo lascerò riposare per uno o due minuti. Ok, dopo uno o due minuti, cercherò di drenare il terreno in eccesso e ora allineerò i fori che sono stati inseriti nel modello con i fori di ingresso e uscita del collettore in plexiglass. E una volta che i fori sono stati allineati, premo con decisione per formare una bella tenuta.

Ora posiziono il collettore in plexiglass sopra i supporti in acciaio inossidabile e ora unirò delicatamente il dispositivo usando le viti. Sto molto attento a non stringere troppo le viti perché questo schiaccerà i canali e posiziono le viti in senso orario per evitare che il gel Agros all'interno di un modello si scanalizzi. Preleverò un milione di terreno e userò questa siringa per testare il dispositivo.

E come puoi vedere, sto iniettando fluido in ogni microcanale e sto cercando che il fluido esca da ogni uscita. Quindi in questo momento ho posizionato il dispositivo assemblato nella camera ambientale del microscopio. Questo viene mantenuto a 37 gradi Celsius, quindi questo riscalderà il dispositivo e lo preparerà per quando avremo bisogno di seminare le cellule.

E come puoi vedere, ho già infilato i due, il tubo della pompa dell'ombrellone attraverso l'installazione. E attualmente sto lavando il tubo con PBS in preparazione per i nostri esperimenti. Quindi ora andremo a configurare il tubo.

Infilerò il tubo della pompa dell'ombrellone attraverso i tappi con i fori già praticati. E ogni tubo ha un numero specifico di tacche su di esso per fare in modo che io possa identificare sia l'ingresso che l'uscita del tubo. Quindi il tubo con quattro tacche su di esso riceverà i 10 nanogrammi per mil.

La soluzione EGF collegherà ora il tubo al dispositivo. Quindi lo collegherò a ciascun dispositivo in base al numero di tacche che ha. Quindi corrisponde alla soluzione che sta adottando.

E ora collego il tubo di uscita. Utilizziamo un tubo tigon trasparente per garantire che il fluido scorra effettivamente attraverso il tubo di uscita e che non vi siano ostruzioni nel canale. E ora inizierò le pompe dell'ombrellone.

Quindi ora inizierò la procedura per seminare le cellule nel canale centrale. Inizierò rimuovendo il supporto in eccesso nel canale del sensore. Quindi ora vedrò le cellule.

Le celle sono già in sospensione in mezzi indipendenti dalla CO2. Ed ero venduto, ero seduto 60 nell'ingresso del canale centrale ed ero seduto 20 microlitri nell'uscita. E si spera che le celle saranno posizionate dal flusso guidato dalla gravità.

E ripeterò questa procedura per gli altri due canali sensibili e ora lo osserveremo al microscopio per vedere se l'inserimento delle cellule ha avuto successo. Quindi ora le cellule hanno aderito al vetrino e in pochi minuti inizieranno a diffondersi e raggiungeranno la loro morfologia unica. Quindi oggi ci siamo occupati dell'assemblaggio del dispositivo vero e proprio, della preparazione dei reagenti e delle tecniche di microscopio che utilizzo per visualizzare la migrazione cellulare all'interno del dispositivo.

In conclusione, speriamo che questo dispositivo abbia un'abdicazione molto più ampia, in particolare in ambito clinico. Quindi figurane uno orizzontalmente. Mostra le traiettorie delle cellule C 17.2 e l'aumento delle concentrazioni di EGF verticalmente.

Mostra le traiettorie dei vari ceppi delle cellule C 17.2 che abbiamo utilizzato nei nostri esperimenti con la stessa concentrazione di EGF. I dati delle cellule parentali mostrano che c'è un picco di motilità al gradiente di concentrazione di EGF di 10 nanogrammi per mil, indicando che i recettori sono diventati saturi di ligando a una concentrazione di EGF più elevata. E i dati wild type mostrano che c'è un aumento della motilità a una concentrazione di cento nanogrammi per mil o EGF.

Ciò indica che i recettori non si saturano a concentrazioni più elevate di EGF. Questo ha senso dal momento che sono stati progettati per sovraesprimere il recettore EGF. Infine, i dati della linea cellulare delta indicano che la motilità delle cellule è approssimativamente indipendente dalla concentrazione di EGF.

Ciò è previsto anche dal momento che i recettori EGF mutati sono stati progettati per essere attivati indipendentemente dalla presenza di EGF.