Caratterizzazione degli spettri di assorbimento biologico che vanno dal visibile all'infrarosso a onde corte

Il nostro laboratorio sviluppa strumenti basati sulla luce che forniscono informazioni diagnostiche per applicazioni di salute materna. Usiamo spesso la spettroscopia ottica a causa della pletora di informazioni relative alla salute che può fornire in modo non invasivo, come il monitoraggio dell'ossigenazione del sangue e della concentrazione di emoglobina, entrambi parametri fisiologici importanti da monitorare durante la gravidanza. Alcuni solventi nell'acqua particellare hanno un forte assorbimento che può mettere in ombra i soluti di interesse.

Inoltre, gli spettri che attraversano la regione VIS-SWIR hanno spesso grandi differenze nell'assorbimento a diversi intervalli di lunghezze d'onda e dobbiamo modificare le impostazioni sperimentali per diverse regioni per ottenere spettri SNL elevati. La difficoltà nell'acquisire spettri biologici VIS-SWIR ha contribuito a limitare gli spettri di assorbimento biologico pubblicati, e il nostro obiettivo è quello di semplificare questo processo. Inoltre, una migliore comprensione delle caratteristiche spettrali specifiche di ciascun componente biologico aiuterà a scegliere lunghezze d'onda ottimizzate che potrebbero ridurre al minimo le distorsioni della pigmentazione cutanea causate da un forte assorbimento di melanina.

Speriamo che il nostro protocollo consenta ai ricercatori di espandere l'attuale libreria VIS-SWIR di assorbitori biologici. Questi risultati evidenziano anche l'impatto della melanina sui dispositivi ottici in funzione della lunghezza d'onda e possono essere utilizzati per progettare sistemi con una distorsione minima della pigmentazione della pelle, come nello SWIR. Per preparare il campione di emoglobina ossigenata con sangue umano intero eparinizzato, pipettare 1,8 millilitri di sangue in una provetta da microcentrifuga.

Centrifugare la provetta a 9,6 g per 10 minuti ed eliminare circa 850 microlitri di surnatante senza disturbare il pellet. Ricostituire il pellet in circa 850 microlitri di acqua deuterata e centrifugare nuovamente a 9,6 g per 10 minuti. Dopo l'ultima centrifugazione, per lisare i globuli rossi, ricostituire i pellet di globuli rossi con 4,5 millilitri di acqua deuterata.

Se il pellet aderisce al tubo, sciacquare con una porzione di acqua deuterata per allentarlo. Utilizzando un ago a punta smussata e una siringa, rimuovere la soluzione di sangue lisata dal tubo. Quindi staccare l'ago a punta smussata dalla siringa e gettarlo in un contenitore per oggetti taglienti a rischio biologico.

Quindi, collegare un filtro per siringa da 0,22 micrometri alla siringa e filtrare il contenuto in un percorso di 10 millimetri, in un vetro da 3,5 millilitri o in una cuvetta di quarzo. Fissare la cuvetta con un tappo ermetico per evitare contaminazioni. Avvolgere Parafilm attorno al tappo per garantire una chiusura completamente ermetica.

Preparare un riferimento riempiendo una cuvetta pulita con lo stesso percorso, lunghezza e volume, con acqua deuterata per le misurazioni di base e di riferimento. Per preparare il campione di emoglobina deossigenata, aggiungere ditionito di sodio alla soluzione di sangue nella cuvetta. Fissare la cuvetta con un tappo ermetico e avvolgere Parafilm attorno al tappo per garantire una chiusura ermetica.

Inclinare con cautela la cuvetta da un lato all'altro fino a quando il ditionito di sodio non è completamente sciolto. Osservare il cambiamento di colore della soluzione di sangue da rosso a un rosso porpora più scuro. Per iniziare, accendi la lampada dello spettrometro e i rivelatori, lasciando che il sistema si riscaldi per 5-20 minuti.

Pulisci le cuvette con etanolo usando un Kimwipe. Per uno spettrometro a doppio raggio, posizionare le cuvette riempite con acqua deuterata come soluzione di riferimento sia nella camera del campione che in quella di riferimento. Selezionare l'intervallo di lunghezze d'onda appropriato e il rivelatore in base alla regione spettrale da misurare.

Ottenere misure di riferimento utilizzando i parametri predefiniti. Quindi, sostituire la cuvetta nella camera del campione con la cuvetta contenente l'emoglobina ossigenata. Passa alla modalità Live per visualizzare l'assorbanza in modo continuo mentre i parametri di misurazione vengono regolati.

Partendo dai parametri predefiniti dello spettrometro, regolare le letture per dato e larghezza di banda per ottenere uno spettro di assorbimento qualitativamente pulito senza saturazione. Se la modifica della potenza della luce incidente, della larghezza di banda, del tempo di esposizione e delle letture per dato non comporta un elevato spettro del rapporto segnale/rumore, modificare la concentrazione del campione, posizionando la cuvetta di riferimento nel campione o nella camera di riferimento o la lunghezza del percorso del campione e il riferimento per ottenere un elevato spettro del rapporto segnale/rumore. Una volta ottimizzate le impostazioni per il campione, documentare le impostazioni per ogni spettro acquisito.

Utilizzando le impostazioni ottimizzate, rimisurare utilizzando le stesse impostazioni con la soluzione di riferimento nelle camere di riferimento e di campionamento per ottenere la misura di riferimento ottimizzata. Quindi, sostituire la cuvetta di riferimento nella camera del campione con la cuvetta del campione di emoglobina ossigenata ed eseguire una misurazione ottimizzata del campione. Salvare separatamente le misure di riferimento e quelle del campione.

Utilizzando la seguente equazione, calcolare l'assorbanza A trattando la misura di riferimento come I0 e la misura del campione come I.Per la post-elaborazione, aprire il software di analisi dei dati come MATLAB e caricare le misure di assorbanza acquisite da diverse regioni dello spettro. Applica un fattore di moltiplicazione a una regione spettrale per unire diverse regioni con concentrazioni di campione o lunghezze di percorso variabili. Lo spettro dell'emoglobina ossigenata ha mostrato una forte correlazione con uno spettro pubblicato da Prahl, con picchi di assorbimento distinti a 415 nanometri e un doppietto tra 540 e 575 nanometri nella regione visibile, insieme a un'ampia caratteristica di assorbimento tra 800 e 1.100 nanometri nel vicino infrarosso.

Nella regione dell'infrarosso a onde corte. Lo spettro dell'emoglobina ossigenata ha mostrato un basso assorbimento, probabilmente a causa del contenuto di acqua residua. Lo spettro dell'emoglobina deossigenata ha mostrato una forte correlazione con lo spettro di Prahl, con picchi prominenti a 430 nanometri, 560 nanometri e 760 nanometri e picchi più piccoli intorno a 1.200 nanometri e tra 1.400 e 1.600 nanometri.