Name: La glicoproteomica guidata dai glifumetti facilita la profilazione completa del glicoproteoma in microambienti tumorali complessi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Scopri la glicoproteomica guidata dai glifumetti per la ricerca sul cancro utilizzando metodi di spettrometria di massa. Questo approccio offre approfondimenti completi sul glicoproteoma nei microambienti tumorali complessi.

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<meta charset="utf8"></head><body>Profilazione dei tessuti tumorali del colon-retto mediante glicoproteomica guidata dai glifumetti

La glicosilazione delle proteine è un tipo prevalente e complesso di modificazione co- e post-traduzionale delle proteine prodotte dalle specie dell'albero filogenetico della vita 1,2,3. È noto che i glicani legati alle proteine hanno un impatto su un'ampia gamma di processi biologici importanti per la salute umana, tra cui la mediazione e la regolazione delle interazioni cellulari e degli eventi di comunicazione 4,5. Si ritiene che la glicosilazione proteica aberrante sia una causa di trasformazione maligna, progressione tumorale e diffusione 6,7,8. Ciò coinvolge i glicani nei processi tumorigenici chiave nel microambiente tumorale (TME) e offre un potenziale considerevole e in gran parte non sfruttato per la scoperta di biomarcatori basati sui glicani e applicazioni terapeutiche. La glicobiologia sta quindi ricevendo una crescente attenzione nella ricerca sul cancro e nelle scienze della vita9.
Alimentati dagli sviluppi chiave della glicoanalitica e dell'informatica nell'ultimo decennio 10,11,12,13,14,15,16,17, i glicomici e la glicoproteomica guidati dalla cromatografia liquida e dalla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) si sono affermati come potenti strumenti per la profilazione a livello di sistema di glicani liberati e glicopeptidi intatti da miscele complesse di glicoproteine estratte direttamente dalle loro origini di campioni biologici come vari tipi di campioni di pazienti oncologici (ad esempio, tessuti tumorali, popolazioni cellulari, fluidi corporei)3,13,18,19,20.
La glicomica fornisce informazioni sulla struttura e la quantità del repertorio dei glicani (il glicoma), che è prodotto dinamicamente da cellule, tessuti e persino interi organismi. D'altra parte, la glicoproteomica fornisce informazioni quantitative sui trasportatori proteici e sul loro sito di glicosilazione, sui tassi di occupazione del sito (macro-eterogeneità), sulle composizioni dei glicani sito-specifici e sul loro modello di distribuzione del sito (micro-eterogeneità) con informazioni strutturali limitate sui glicani (spesso limitate alla composizione dei glicani)15,16,21. Pertanto, la glicomica e la glicoproteomica sono approcci complementari per esaminare i dettagli biochimici del glicoproteoma22.
Una miriade di disegni metodologici e strategie analitiche per la glicomica e la glicoproteomica sono stati sviluppati e applicati in tutti i laboratori a seconda del glicoanalita di interesse (ad esempio, N-/O-/C-linked, glicano/glicopeptide/glicoproteina, marcato/non marcato), della natura del campione (ad esempio, cellule, tessuti, fluidi corporei), della quantità (livelli di proteine nanogrammi/microgrammi/milligrammi) e dello strumento analitico disponibile23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32. Nonostante i vantaggi riconosciuti del loro uso parallelo, la glicomica e la glicoproteomica non sono comunemente applicate insieme, ma piuttosto come approcci autonomi negli studi di ricerca glicobiologica e sul cancro a causa della loro elevata richiesta di competenze analitiche e strumentazione specializzata.
Riconoscendo questa lacuna tecnologica, più di un decennio fa, abbiamo introdotto il metodo della glicoproteomica assistita da glicomica, che è in grado di integrare dati glicomici e glicoproteomici ottenuti da campioni biologici complessi33. In sintesi, la tecnologia glicoproteomica assistita da glicomici (o guidata da glicomici come in questo protocollo) profila gli N- e/o O-glicani attraverso un consolidato carbonio grafitato poroso (PGC) metodo LC-MS/MS34,35, che vengono poi utilizzati per l'analisi di dati intatti di N- e/o O-glicopeptidi acquisiti dallo stesso campione o dagli stessi campioni definendo i confini dello spazio di ricerca dei glicani36. PGC-LC-MS/MS è un metodo glicomico particolarmente potente in quanto fornisce informazioni quantitative sul glicoma con elevata sensibilità e risoluzione strutturale, fornendo informazioni sulla topologia (sequenza monosaccaridica e pattern di ramificazione) e sui legami glicosidici dei glicani anche all'interno di miscele complesse 35,37,38 . Il flusso di lavoro della glicoproteomica prevede la generazione di peptidi, la marcatura opzionale dei peptidi, il multiplexing e il prefrazionamento, nonché l'arricchimento prima dell'analisi LC-MS/MS in fase inversa che impiega idealmente diversi metodi di frammentazione, tra cui l'energia di collisione a gradini/dissociazione collisionale ad alta energia (sceHCD, per N-glicopeptidi) e il trasferimento di elettroni/dissociazione collisionale ad alta energia (EThcD, per O-glicopeptidi) per l'identificazione dell'analita. Per l'analisi dell'N-glicoproteoma, la de-N-glicoproteomica parallela può guidare l'analisi dei dati di N-glicopeptidi intatti definendo lo spazio di ricerca proteina/peptide e fornendo maggiori dettagli sui siti di N-glicosilazione occupati e sul loro tasso di occupazione del sito, mentre l'analisi parallela di peptidi non modificati rivela eventuali variazioni del livello proteico tra le condizioni studiate.
Questo documento fornisce un protocollo dettagliato e facile da seguire passo dopo passo per il metodo della glicoproteomica guidata dai glifumetti (vedere la Figura 1 per una panoramica del flusso di lavoro). Il protocollo fornisce dettagli sperimentali sulle fasi di preparazione del campione e sugli esperimenti di glicomica e glicoproteomica basati su LC-MS/MS e presenta risultati rappresentativi che dimostrano l'applicazione del metodo a sezioni di tessuto FFPE (FFPE) fissate in formalina di tumori resecati da pazienti con cancro del colon-retto (CRC), consentendo di comprendere la glicobiologia del TME in un prezioso tipo di campione archiviato nelle biobanche oncologiche di tutto il mondo. Vengono inoltre brevemente discusse l'analisi e l'integrazione dei dati di glicomica e glicoproteomica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67405/67405fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Panoramica del metodo glicoproteomico guidato dai glifumetti. La panoramica mostra le fasi sperimentali dettagliate nei flussi di lavoro della glicomica (a sinistra) e della glicoproteomica (a destra), con una panoramica delle informazioni ottenute (in grassetto) e di come i due approcci sono integrati attraverso una migliore analisi e interpretazione dei dati. Inserto: Microcolonne SPE autoprodotte utilizzate per i flussi di lavoro (i) glicomica e (ii-iii) glicoproteomica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67405/67405fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td><forte>Sostanze chimiche</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetato di ammonio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1542</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio, purezza &ge; 99,0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Acetonitrile anidro (ACN), grado LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34851</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Fetuin bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3004</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Acido formico, grado LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>00940</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Iodoacetamide (IAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1775</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Peptide-N-glicosidasi F (PNGasi F)</td><td>Promega</td><td>V4831</td><td>Elizabethkingia miricola PNGasi F (10 U/&mu; L) espresso in modo ricombinante in Escherichia coli&nbsp;</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidone 40 (PVP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PVP40</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Idrossido di potassio (KOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484016</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Tripsina suina di grado sequenziante&nbsp;</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Boroidruro di sodio (NaBH4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213462</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Bicarbonato di trietilammonio (TEAB), grado LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico (TFA), grado LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Strumenti/Materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 dischi</td><td>Empore</td><td>66883-U</td><td></td></tr><tr><td>Dischi C8</td><td>Empore</td><td>66882-U</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti in polipropilene a fondo piatto&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3364</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in polivinilidene difluoruro (PVDF) Immobilon-PSQ</td><td>Millipore</td><td>IPVH20200</td><td>Dimensione dei pori: 0,45 &mu; m&nbsp;</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5452000069</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Adattatori per microcentrifuga&nbsp;</td>Il collare a colonna MiniSpin <td>di Nest Group, Inc., MA</td><td>SS18V</td><td>, viene fornito con colonne Microspin</td></tr><tr><td>Oligo R3 resina</td><td>Thermo</td><td>1133903</td><td>Dimensione delle particelle 30 &mu; m</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Provette Protein LoBind 1,5 mL</td> Provette <td>Eppendorf</td><td>0030108450</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind 2,0 mL</td><td>Provette Eppendorf</td><td>0030108442</td><td></td></tr><tr><td>Safe-lock 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Provette Safe-lock 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>5382000066</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Perforatrice monoforo</td><td>Swingline</td><td>74005</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore SpeedVac</td><td>Martin Christ</td><td>RVC 2-25 CDplus</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Supelclean ENVI-Carb Resina SPE</td><td>Supelco</td><td>57088</td><td>Granulometria 120-400 mesh. La resina può essere estratta manualmente dalle cartucce e può essere conservata a lungo termine in metanolo al 50% (v/v) in siringa d'acqua MilliQ</td></tr><tr><td>5 mL Sigma</td><td>Aldrich</td><td>Z116866</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Incubatore a temperatura controllata</td><td>Thermoline</td><td>E7.30</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Bagno ad ultrasuoni</td><td>Unisonics</td><td>FXP</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Resina ZIC-HILIC</td><td>Merck</td><td>150455</td><td>Dimensione delle particelle/pori, 5 &mu; m/200 &Aring;. La resina può essere estratta manualmente dalla colonna LC e può essere conservata a lungo termine in metanolo al 50% (v/v) in</td></tr><tr><td>microcolonne di estrazione in fase solida (SPE) ad acqua MilliQ ZipTip C18</td>.<td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td>In alternativa, le microcolonne C18-SPE fatte in casa possono sostituire il prodotto commerciale</td></tr><tr><td>LC-MS/MS Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1260 Sistema HPLC capillare Infinity&nbsp;</td><td>Alternative Agilent</td><td></td><td>disponibili</td></tr><tr><td>Colonna LC analitica preconfezionata con resina ReproSil-Pur C18 AQ</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germania</td><td>r13.aq.s2570</td><td>Dimensione delle particelle/pori: 3 &mu; m/120 &Aring;, lunghezza/diametro interno: 25 cm/75 &m. Disponibili anche colonne commerciali C18 nano-LC/&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC&nbsp;</td><td>Alternative termiche</td><td></td><td>disponibili</td></tr><tr><td>Colonna LC capillare HyperCarb KAPPA PGC&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>Interrotto</td><td>Dimensione delle particelle/pori, 3 &mu; m/250 &Aring;; lunghezza colonna, 30 mm; diametro interno, 0,180 mm. Sono disponibili in commercio geometrie più grandi delle colonne HyperCarb PGC-LC, che producono dati di qualità simile (ad esempio, Thermo #35003-031030). Colonna LC SupelTMCarb di Merck con dimensione particelle/pori, 2,7 &mu; m/200 e con diverse lunghezze di colonna e diametro interno (ad esempio, Merck #59994-U).&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetonitrile di grado LCMS</td><td>LiChrosolv</td><td>100029</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Spettrometro di massa a trappola ionica a quadrupolo lineare (LTQ) Velos Pro (glicomiche)&nbsp;</td><td>Alternative Thermo</td><td></td><td>disponibili</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer (glicoproteomica)</td><td>Thermo</td><td></td><td>Sono disponibili anche altri sistemi MS ad alta risoluzione con o senza ETD (necessari solo per l'O-glicoproteomica) (ad esempio, Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker o spettrometri di massa simili ad alte prestazioni di altri fornitori)</td></tr><tr><td>Recupero totale Fiale a vite in vetro trasparente da 0,9 mL</td><td>Thermo</td><td>THC11093563</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Recupero totale Flaconi a vite in vetro trasparente tappi corrispondenti Thermo</td><td></td><td>THC09150869</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Colonna Trap LC confezionata internamente con resina ReproSil-Pur C18 AQ</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germania</td><td>r15.aq.s0202</td><td>Dimensione particelle/pori: 5 &mu; m/120 &Aring;, lunghezza/diametro interno: 2 cm/100 &m. Sono disponibili anche colonne LC trappola commerciali C18.&nbsp;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Byonic</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v2.6.46 o superiore</td><td>Motore di ricerca commerciale di glicopeptidi e PTM, che accetta dati grezzi LC-MS/MS dalla maggior parte dei fornitori di MS Byos</td></tr><tr><td></td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v3.9-7 o superiore</td><td>Software commerciale per l'ispezione manuale dei candidati glicopeptidi e l'annotazione automatica degli spettri MS/MS dei glicani</td></tr><tr><td>GlycoMod</td><td>Expasy</td><td></td><td>Software ad accesso aperto, che assiste l'annotazione dei dati glicomici (https://web.expasy.org/glycomod/)</td></tr><tr><td>GlycoWorkBench</td><td>EUROCarbDB</td><td>v2.1</td><td>Software ad accesso aperto, che assiste l'annotazione dei dati glicomici e il disegno di cartoni animati di glicani</td></tr><tr><td>RawMeat</td><td>VAST Scientific</td><td>v2.1</td><td>Software ad accesso aperto, che estrae m/z di ioni precursori dei glicani da dati spettrali grezzi</td></tr><tr><td>Skyline</td><td>Brendan X. MacLean</td><td>v21.2 o superiore</td><td>Software ad accesso aperto per la quantificazione relativa dei glicani</td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>Thermo</td><td>v2.2 o superiore</td><td>Per la navigazione dei dati grezzi LC-MS/MS</td></tr></tbody></table>

la glicoproteomica guidata dai glifumetti facilita la profilazione completa del glicoproteoma in microambienti tumorali complessi 

Glycomics-Guided Glycoproteomics Facilitates Comprehensive Profiling of the Glycoproteome in Complex Tumor Microenvironments

In questa sezione vengono forniti i risultati rappresentativi del metodo glicoproteomico guidato dai gliomici applicato a un vetrino di tessuto FFPE da un paziente affetto da CRC in stadio II.
Per ottenere un materiale proteico di partenza sufficiente per il protocollo, gli estratti proteici da due vetrini (pile z) sono stati combinati dallo stesso blocco di tessuto FFPE seguendo un protocollo pubblicato ed è stato applicato un approccio di marcatura TMT per aumentare la sensibilità dell'esper...

La glicoproteomica guidata dai glifumetti facilita la profilazione completa del glicoproteoma in microambienti tumorali complessi 

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven ...

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