Imaging del calcio a singola cellula per lo studio dell'attivazione dei canali ionici del calcio
13 dicembre 2024
Questo articolo presenta un metodo per il monitoraggio quantitativo in tempo reale delle concentrazioni di ioni calcio (Ca2+) nelle cellule utilizzando l'imaging Ca2+ a singola cellula con il colorante Fura-2/AM. Questa tecnica consente un caricamento efficiente del colorante e un calcolo accurato dei livelli di Ca2+ attraverso i rapporti di intensità della fluorescenza, rendendola un approccio semplice e rapido per le applicazioni di ricerca.
Abbiamo studiato i nostri canali relativi alla sensazione di temperatura, alla sensazione di età e alla sensazione di dolore. Siamo interessati allo screening delle attività di piccole molecole nei nostri canali e allo studio dei loro meccanismi. Abbiamo esaminato due agonisti attivanti TRPV1 e condotto uno studio dettagliato sui loro meccanismi d'azione.
Questa tecnologia consente il monitoraggio in tempo reale, quantitativo e simultaneo delle variazioni di calcio in più cellule, il che la rende un approccio semplice e rapido per le applicazioni di ricerca. Il nostro obiettivo è quello di esplorare il meccanismo di trattamento delle medicine tradizionali cinesi per le varie malattie attraverso la modernizzazione dei canali ionici correlati al calcio. Per iniziare, preparare vetrini sterili con diametro di otto millimetri e metterli in una piastra a 24 pozzetti.
Aggiungere 500 microlitri di tampone Poli-D-licina a ciascun pozzetto. Incubare i vetrini a 37 gradi Celsius per un'ora per consentire il rivestimento. Quindi, utilizzando una pipetta, scartare la soluzione di rivestimento da ciascun pozzetto.
Lavare le diapositive una volta con il PBS di Dulbecco e mettere da parte le diapositive lavate per un uso successivo. Seminare le cellule sulla piastra a 24 pozzetti preparata a una densità di circa 1,5 volte 10 alla potenza di 5 cellule per pozzetto e posizionare la piastra nell'incubatore fino a quando le cellule non diventano aderenti. Quindi, mescolare la soluzione madre di Fura-2/AM e Pluronic F-127 con il tampone di Hank contenente 1,3 millimolari di ioni calcio.
Utilizzando un foglio di alluminio, coprire la soluzione di lavoro Fura-2/AM per proteggerla dalla luce. Per il pretrattamento delle cellule, trasferire i vetrini con le celle in una nuova piastra a 24 pozzetti contenente il tampone di Hank. Utilizzando una pipetta, scartare il tampone da ciascun pozzetto e aggiungere 500 microlitri di tampone di lavoro Fura-2/AM a ciascun pozzetto.
Incubare la piastra a temperatura ambiente al buio per 30 minuti per consentire il caricamento della sonda. Quindi rimuovere il tampone di lavoro Fura-2/AM da ciascun pozzetto e lavare le celle tre volte con il tampone di Hank per rimuovere l'eccesso di Fura-2/AM. Per iniziare, ottenere le cellule pretrattate per l'imaging del calcio a singola cellula e avviare tutti i componenti del microscopio a fluorescenza.
Apri il software di imaging a fluorescenza dalle opzioni disponibili. Seleziona il protocollo richiesto e fai clic su OK. Quindi, scegli Nuovo esperimento dal menu principale per avviare una nuova configurazione sperimentale.
Ora, montare la camera di perfusione sul tavolino del microscopio e posizionare con cura i vetrini cellulari trattati con Fura-2/AM nella camera contenente la soluzione tampone di Hank. Regola la messa a fuoco sotto la luce bianca per una visione ottimale. Selezionare Messa a fuoco nel pannello di controllo dell'esperimento.
Scegli la lunghezza d'onda desiderata per la messa a fuoco, ad esempio 380 nanometri, e fai clic su Inizia messa a fuoco per avviare le regolazioni focali. Regola la messa a fuoco sulle celle usando Messa a fuoco approssimativa per avvicinare l'obiettivo, seguito da Trova messa a fuoco per regolazioni precise. Osservare l'espressione della proteina bersaglio mediante lunghezze d'onda di FITC o TRITC.
Quindi fare clic su Interrompi messa a fuoco e chiudere il pannello di messa a fuoco. Fare clic su Configura esperimento nella barra delle applicazioni e selezionare i piani desiderati per l'imaging nelle impostazioni di configurazione. Ora fai clic sul pulsante Regione nella barra dei menu per definire le aree per l'imaging e scegli il tipo di illuminazione desiderato per l'imaging.
Fare clic su Acquisisci immagini, quindi premere OK per acquisire le immagini. Identificare le cellule desiderate che esprimono la proteina bersaglio sotto fluorescenza, considerando la lettura in bianco con i controlli inferiori a 380 nanometri. Per annullare una regione selezionata, fare clic con il pulsante destro del mouse sul cerchio e selezionare Elimina regione.
Apri il menu Riferimenti, seleziona la casella Sottrai riferimenti e quindi fai clic su OK per applicare la sottrazione dello sfondo. Nel pannello di controllo Esperimento, fare clic su Log Data (Registra dati) per registrare i dati dell'esperimento. Nella sezione Time Lapse del pannello di controllo, impostare l'intervallo di acquisizione dati su un secondo.
Quindi fare clic su Zero Clock and Acquire sul pannello di controllo Esperimento per avviare l'acquisizione dei dati. Ora applica i trattamenti alle cellule secondo i requisiti. Una volta completata l'acquisizione dei dati, fare clic su Pausa per interrompere il processo.
Salvare i dati acquisiti e procedere con l'analisi. Per terminare l'esperimento, fai clic su File e seleziona Chiudi esperimento. Infine, chiudi il software e trasferisci tutti i dati salvati dal computer.
I cheratinociti primari caricati con la sonda Fura-2 hanno mostrato una morfologia cellulare visibile a una lunghezza d'onda di 380 nanometri. La risposta termica dei cheratinociti ha mostrato un aumento della concentrazione intracellulare di ioni calcio durante il riscaldamento con una risposta simile osservata durante il raffreddamento. La risposta termica è stata abolita nei cheratinociti, privi del gene STIM1 che indica il ruolo del gene nella segnalazione termica del calcio.
HEK293T cellule che esprimono STIM1/Orai1 hanno mostrato una notevole risposta termica dopo il raffreddamento, confermando il successo dell'espressione genica, come evidenziato dai marcatori di fluorescenza verdi e rossi. La risposta di ingresso del calcio operata dal deposito nelle cellule che esprimono STIM1-Orai1 è stata efficacemente indotta da cambiamenti sequenziali nella concentrazione extracellulare di calcio e nell'edizione dell'acido ciclopiazonico tramite profusione. Il pipettaggio diretto della capsaicina, un agonista di TRPV1, ha innescato l'afflusso extracellulare di calcio nelle cellule che esprimono il plasmide TRPV1.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per il monitoraggio quantitativo in tempo reale degli ioni calcio (Ca2+) concentrazioni nelle cellule utilizzando il calcio a livello di singola cellula2+ imaging con il colorante Fura-2/AM. La tecnica è efficace per lo studio dei canali della termosensibilità e del dolore, consentendo un efficiente caricamento del colorante e un accurato calcolo del Ca2+ livelli attraverso i rapporti di intensità della fluorescenza.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Segnalazione del calcio
Sfondo
- Canali studiati correlati alla sensazione della temperatura e al dolore.
- Screening di molecole piccole che influenzano i canali TRPV1.
- Il monitoraggio in tempo reale consente l'osservazione simultanea di più cellule.
- I cambiamenti nella concentrazione degli ioni calcio sono fondamentali per comprendere i meccanismi sensoriali.
Scopo dello studio
- Studiare i meccanismi di attivazione degli agonisti del TRPV1.
- Analizzare i meccanismi terapeutici delle medicine tradizionali cinesi attraverso i canali ionici legati al calcio.
- Fornire un approccio rapido per applicazioni di ricerca nelle risposte cellulari.
Metodi Utilizzati
- Tecnica di imaging a singola cellula mediante il colorante Fura-2/AM.
- Culture cellulari di cheratinociti e cellule HEK293T che sovraesprimono proteine legate al segnale del calcio.
- Protocolli di incubazione e trattamento per il caricamento del colorante e l'acquisizione dei dati.
- È stata impiegata la microscopia a fluorescenza per monitorare le risposte cellulari.
Risultati principali
- I cheratinociti hanno mostrato un aumento delle concentrazioni intracellulari di calcio durante il riscaldamento e il raffreddamento.
- Le risposte erano associate alla presenza del gene STIM1, evidenziandone il ruolo nella segnalazione termica del calcio.
- Gli agonisti del TRPV1 hanno innescato un significativo affluxo di calcio nelle linee cellulari modificate.
- Sono stati dimostrati percorsi di segnalazione del calcio efficaci, per un'eventuale esplorazione terapeutica.
Conclusioni
- Lo studio dimostra un metodo robusto per monitorare la dinamica degli ioni calcio in cellule vive.
- Migliora la comprensione dei canali sensoriali coinvolti nella regolazione del dolore e della temperatura, fondamentali per lo sviluppo di nuovi trattamenti.
- Le implicazioni generali includono una migliore comprensione dei meccanismi neuronali e possibili applicazioni nei modelli di malattia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'imaging del calcio a singola cellula mediante Fura-2/AM consente una valutazione quantitativa in tempo reale dell'attivazione dei canali per ioni calcio in risposta a stimoli diversi, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nella fase iniziale della scoperta. Questo approccio fornisce dati ad alto contenuto informativo e multiplex essenziali per la validazione del bersaglio e la caratterizzazione funzionale dei canali ionici coinvolti nei percorsi sensoriali. Il metodo aumenta l'affidabilità predittiva in punti critici dei portafogli di scoperta di farmaci su canali ionici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente l'interrogazione diretta dei meccanismi di attivazione dei canali del calcio sotto stimolazione controllata.
- Permette la validazione funzionale di bersagli di canali ionici endogeni e sovraespressi.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico collegando perturbazioni genetiche o farmacologiche a risposte cellulari quantitative.
- Fornisce dati multiplex a risoluzione monocellulare per un'elevata affidabilità del bersaglio.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce letture quantitative standardizzate per lo sviluppo e l'ottimizzazione dei saggi.
- Consente misurazioni riproducibili del flusso di calcio in risposta ad agonisti o antagonisti di piccole molecole.
- Facilita la predisposizione per lo screening consentendo il monitoraggio simultaneo di più cellule e condizioni.
- Genera dati in formato .XLSX per un'analisi successiva e un'integrazione semplificate.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i riscontri funzionali a vie biologiche rilevanti per la malattia, come la sensazione del dolore e della temperatura.
- Consente una transizione continua dai modelli cellulari alla validazione preclinica di modulatori dei canali ionici.
- Supporta lo sviluppo di biomarcatori traslazionali quantificando le risposte cellulari a terapie sperimentali.
- Fornisce informazioni meccanicistiche per prendere decisioni di avanzamento con valutazione del rischio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo flusso di lavoro di imaging del calcio a singola cellula collega la fase iniziale della scoperta, lo sviluppo del saggio e la ricerca traslazionale per i bersagli dei canali ionici.
- Biologia della scoperta: L'imaging quantitativo del calcio supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi per i canali ionici sensoriali.
- Screening: Misure standardizzate del rapporto di fluorescenza consentono una valutazione riproducibile dei composti e una scalabilità del saggio.
- Analisi: Output quantitativi in tempo reale facilitano il confronto statistico tra condizioni sperimentali e l'interpretazione meccanicistica.
- Ricerca traslazionale: Dati funzionali sull'attivazione dei canali informano la selezione dei modelli preclinici e l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: La piattaforma di imaging e la pipeline di analisi sono adattabili a diversi bersagli di canali ionici e sistemi cellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi dei canali ionici.
- Valore operativo: Ottimizza l'acquisizione, la standardizzazione e la riproducibilità dei dati tra diversi esperimenti.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto e migliora l'efficienza del capitale fornendo dati funzionali solidi già nelle fasi iniziali del processo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e lo sviluppo di modulatori dei canali ionici con un'adeguata gestione del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a fluorescenza e analisi quantitativa delle immagini.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per imaging calibrata e a software di analisi compatibili.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per il caricamento delle sonde, i protocolli di stimolazione e l'elaborazione dei dati.
- È adattabile a diversi tipi cellulari che esprimono canali ionici endogeni o ricombinanti.
- Le limitazioni potenziali includono il fotoblecamento e la necessità di un controllo accurato dell'efficienza di caricamento delle sonde.
