Name: Imaging del calcio a singola cellula per lo studio dellattivazione dei canali ionici del calcio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Impara l'imaging del calcio a singola cellula con il colorante Fura-2/AM per studiare i canali TRPV1 legati a temperatura e dolore. Questo metodo permette il monitoraggio quantitativo in tempo reale delle concentrazioni ioniche.

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<meta charset="utf8"></head><body>Imaging del calcio a singola cellula per studi di attivazione dei canali

<ol><li>Murthy, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+for+contraction+and+relaxation+in+smooth+muscle+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signaling for contraction and relaxation in smooth muscle of the gut.</a> Annu Rev Physiol. 68, 345-374 (2006).</li>
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<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+analysis+of+stim1+thermal+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism analysis of stim1 thermal sensation.</a> Cells. 12 (22), 2613(2023).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+safeguards+organelle+homeostasis+and+cellular+aging+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discov%22%5BJournal%5D)">ATF6 safeguards organelle homeostasis and cellular aging in human mesenchymal stem cells.</a> Cell Discov. 4, 2(2018).</li>
<li>Jiang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanosensitive+piezo1+channel+mediates+heart+mechano-chemo+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The mechanosensitive piezo1 channel mediates heart mechano-chemo transduction.</a> Nat Commun. 12 (1), 869(2021).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Orai1-mediated+store-operated+Ca%282%2B%29+channel%2Fcalpain+signaling+contributes+to+high+glucose-induced+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced Orai1-mediated store-operated Ca(2+) channel/calpain signaling contributes to high glucose-induced podocyte injury.</a> J Biol Chem. 298 (6), 101990(2022).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+er+ion+homeostasis+maintained+by+an+er+anion+channel+clcc1+contributes+to+als-like+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Disruption of er ion homeostasis maintained by an er anion channel clcc1 contributes to als-like pathologies.</a> Cell Res. 33 (7), 497-515 (2023).</li>
<li>Gouin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trpv1+and+trpa1+in+cutaneous+neurogenic+and+chronic+inflammation%3A+Pro-inflammatory+response+induced+by+their+activation+and+their+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Trpv1 and trpa1 in cutaneous neurogenic and chronic inflammation: Pro-inflammatory response induced by their activation and their sensitization.</a> Protein Cell. 8 (9), 644-661 (2017).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+fura-2+am%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am.</a> J Vis Exp. (23), e1067(2009).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lever-like+transduction+pathway+for+long-distance+chemical-+and+mechano-gating+of+the+mechanosensitive+piezo1+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A lever-like transduction pathway for long-distance chemical- and mechano-gating of the mechanosensitive piezo1 channel.</a> Nat Commun. 9 (1), 1300(2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Macchina fotografica</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capsaicine</td><td>Sigma</td><td>211275</td><td></td></tr><tr><td>regolatore di temperatura CL-100</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido ciclopiazonico (CPA)</td><td>Sigma</td><td>C1530</td><td></td></tr><tr><td>DG-4 luce</td><td>Sutter Instrument Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Software di imaging a fluorescenza (MetaFluor, software a pagamento)&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2/AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>HBSS tampone</td><td>Gibco</td><td>14175103</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>&nbsp; Beyotime</td><td>ST501</td><td></td></tr><tr><td>poli-D-lisina</td><td>&nbsp; Dispositivo di</td> riscaldamento/raffreddamento a circolazione di liquido Beyotime <td>ST508</td><td></td></tr><tr><td>SC-20</td><td>Apparato Harvard Sorgente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>di luce bianca</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging del calcio a singola cellula per lo studio dell'attivazione dei canali ionici del calcio

Single-Cell Calcium Imaging for Studying the Activation of Calcium Ion Channels

Rilevamento della risposta alla temperatura 
Cheratinociti primari I cheratinociti primari sono stati isolati da topi neonati e preparati secondo i protocolli stabiliti10. Queste cellule sono state seminate in piastre a 24 pozzetti contenenti vetrini. Dopo il caricamento della sonda Fura-2, la messa a fuoco è stata regolata al microscopio a una lunghezza d'onda di 380 nm per ottenere una chiara visualizzazione della morfologia cellulare, come illustrato nella Figura 2A. Se la sonda non veniva caricata correttamente durante il processo, le celle non sarebbero visibili. Il tampone extracellulare nella camera è stato continuamente sostituito attraverso un sistema di perfusione, garantendo condizioni ottimali per le cellule. Il sistema di controllo della temperatura è stato collegato al sistema di perfusione, consentendo il rilevamento delle risposte termiche cellulari controllando le variazioni di temperatura nel tampone extracellulare. Questo processo prevedeva il riscaldamento graduale del tampone extracellulare e poi il suo graduale raffreddamento.
Il sistema di imaging a cellula singola di Ca2+ è stato utilizzato per monitorare i cambiamenti nella concentrazione intracellularedi Ca 2+ in varie condizioni sperimentali. Come mostrato nella Figura 2B, i cheratinociti hanno mostrato una risposta termica distinta quando sottoposti a riscaldamento, nonché una risposta notevole durante la fase di raffreddamento. In particolare, questa risposta alla temperatura è scomparsa quando il gene STIM1, che è il principale responsabile di questa risposta, è stato eliminato (Figura 2C)10. L'imaging di Ca2+ a singola cellula consente l'osservazione in tempo reale delle variazioni della concentrazione intracellulare di Ca2+ in risposta a vari stimoli esterni, consentendo un'analisi dettagliata del comportamento cellulare e della segnalazione.
HEK293T cellule che sovraesprimono i plasmidi bersaglio HEK293T cellule sono state seminate in una piastra a 24 pozzetti contenente vetrini secondo il metodo sperimentale. Le cellule sono state quindi sovraespresse con STIM1/Orai1 e la loro risposta termica mediata è stata rilevata utilizzando lo stesso metodo descritto sopra per le cellule primarie. Nel caso di cellule che sovraesprimono il plasmide bersaglio, il successo della trasfezione è stato confermato selezionando cellule che esprimevano il plasmide corrispondente, come indicato dalle proteine fluorescenti rosse o verdi trasportate dal plasmide sotto lunghezze d'onda TRITC o FITC. Per questo esperimento, sono stati utilizzati plasmidi STIM1-GFP/Orai1-DsRed, con GFP rilevato sotto FITC, che emette fluorescenza verde, e DsRed rilevato sotto TRITC, che emette fluorescenza rossa. Le cellule che sovraesprimono mCherry vuoto (TRITC) sono state utilizzate come controlli negativi. Come mostrato nella Figura 3A, le celle fluorescenti osservate nell'ambito di FITC hanno indicato un'espressione riuscita di STIM1, consentendo la selezione e la registrazione della loro risposta termica durante i processi di riscaldamento e raffreddamento. Le cellule che non sono state trasfettate sono servite come controllo negativo. La Figura 3B dimostra che STIM1/Orai1 ha mostrato una risposta termica significativa durante il processo di raffreddamento, in contrasto con il controllo negativo mostrato nella Figura 3C.
Rilevamento della risposta ai farmaci La tecnologia di imaging Ca2+ a cellula singola può essere utilizzata anche per rilevare le risposte cellulari ai composti. La preparazione della cella per il rilevamento della risposta termica è la stessa descritta sopra. La differenza tra risposta ai farmaci e risposta termica risiede nel fatto che la risposta termica di solito richiede l'attivazione delle cellule modificando la temperatura del tampone extracellulare attraverso un sistema di perfusione, mentre i composti possono essere somministrati sia attraverso la perfusione che aggiungendoli direttamente utilizzando una pipetta. L'aggiunta diretta con una pipetta può conservare efficacemente la quantità di composto utilizzato; Tuttavia, la curva risultante potrebbe non essere sempre visivamente accattivante come quella ottenuta attraverso la perfusione.
Prendendo la Figura 4 come esempio, la Figura 4A mostra la risposta di ingresso nel calcio (SOCE) di STIM1/Orai1, in cui la concentrazione extracellulare di Ca2+ e il contenuto di acido ciclopiazonico (CPA) vengono modificati in sequenza attraverso un sistema di perfusione per indurre SOCE. Nella Figura 4B, l'agonista TRPV1 capsaicina viene aggiunto direttamente utilizzando una pipetta alle cellule che sovraesprimono il plasmide TRPV1. La capsaicina può attivare TRPV1 e indurre l'afflusso extracellulare di Ca2+ .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig01.jpg">
Figura 1: Diagramma schematico di Fura-2 AM. Fura-2 è una sonda a fluorescenza di Ca2+ comunemente usata in biologia cellulare che si lega selettivamente al Ca2+ in un rapporto 1:1 ed emette fluorescenza. A causa della sua natura altamente polare come composto acido, Fura-2 non può entrare nelle cellule. Per migliorare la permeabilità cellulare, viene coniugato con acetossimetile (AM) sul suo gruppo negativo per formare Fura-2/AM. Questa modifica aumenta la sua solubilità dell'estere ed elimina la carica negativa. All'interno delle cellule, Fura-2/AM viene idrolizzato dalle esterasi in Fura-2, che può legarsi in modo reversibile con il Ca2+ citoplasmatico libero. Al momento del legame, la lunghezza d'onda massima di eccitazione passa da 380 nm a 340 nm (quando satura di Ca2+). L'intensità della fluorescenza emessa è quantitativamente correlata alla concentrazione di Ca2+ legato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig02.jpg"> 
Figura 2: Rilevamento della risposta alla temperatura dei cheratinociti primari. (A) Colorazione con fura-2 di cheratinociti da topi neonati, osservata sotto una lente obiettiva 20x. (B,C) Risposta alla temperatura dei cheratinociti WT (B) e dei cheratinociti knockout STIM1 (C) utilizzando un sistema di imaging Ca2+ a cellula singola. Ingrandimento: 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig03.jpg"> 
Figura 3: Rilevamento della risposta alla temperatura di STIM1-GFP/Orai1-Dsred sovraespresso in celle HEK293T. (A) Una figura rappresentativa che mostri cellule positive che esprimono STIM1-GFP secondo FITC. (B,C) Risposta alla temperatura delle cellule HEK293T che esprimono il rispettivo plasmide rilevato da un sistema di imaging Ca2+ a cellula singola. Ingrandimento: 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig04.jpg"> 
Figura 4: Rilevamento della risposta ai farmaci mediante imaging Ca2+ a cellula singola. (A) Risposta SOCE di cellule HEK293T che sovraesprimono STIM1/Orai1. Il tampone extracellulare viene modificato da Ca2+-contenente a Ca2+-libero utilizzando un sistema di perfusione. In assenza di Ca2+, il CPA viene aggiunto per esaurire il Ca2+ dal reticolo endoplasmatico. Il tampone extracellulare viene quindi sostituito con un tampone contenente Ca2+ per indurre l'afflusso extracellularedi Ca 2+ , che rappresenta l'ingresso di Ca2+ gestito dal negozio. L'imaging di Ca2+ a singola cellula viene utilizzato per registrare dinamicamente le variazioni della concentrazione citosolica di Ca2+ indotte da questi processi. (B) HEK293T cellule che sovraesprimono TRPV1-mRuby, dove mRuby è una proteina fluorescente utilizzata per controllare la condizione di trasfezione della proteina TRPV1. La capsaicina viene aggiunta utilizzando una pipetta mentre l'afflusso di Ca2+ viene registrato mediante imaging di Ca2+ a cellula singola. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Imaging del calcio a singola cellula per lo studio dell'attivazione dei canali ionici del calcio

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and ...

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