Registrazione delle correnti K⁺ rettificanti verso l'interno nelle cellule muscolari lisce dell'arteria basilare appena isolate mediante tecnica di patch clamp

La mia ricerca si concentra principalmente sull'elettrofisiologia cardiocerebrovascolare. Questo studio descrive un metodo per isolare le cellule muscolari vascolari primarie e utilizzare la tecnologia del pinch clamp a cellula intera per assistere le loro proprietà elettrofisiologiche. L'isolamento di cellule fresche ha limitazioni come l'impatto della temperatura sulla separazione degli enzimi, la variazione dei tempi di digestione per i diversi vasi sanguigni e la capacità istantanea nell'ambiente nativo delle cellule.

Inoltre, la tecnologia del morsetto a pinza presenta sfide nella rottura del soffitto e della membrana che richiede un funzionamento qualificato. Questo protocollo facilita la ricerca nell'acquisizione immediata di cellule primarie attive dalle arterie manuali e deve rapidamente suonare l'applicazione della tecnica del pinch clamp. Per iniziare, riempire una capsula di Petri con una soluzione salina fisiologica fredda satura di ossigeno al 95% e anidride carbonica al 5%.

Metti un cervello di ratto isolato nella capsula di Petri. Posiziona il cervello ventralmente verso l'alto nella capsula di Petri e fissalo con degli aghi. Al microscopio ottico, individuare l'arteria basilare.

Con autoclave, pinzette e forbici, rimuovere con cura il tessuto circostante. Successivamente, inserire un filo lungo due centimetri con un diametro di 25 micrometri nell'arteria basilare isolata. Strofinare delicatamente la parete interna dell'arteria con il filo per rimuovere efficacemente l'endotelio vascolare.

Per isolare le cellule muscolari lisce, per prima cosa, preriscaldare le soluzioni in provette da una a tre. Trasferire l'arteria basilare isolata nella provetta due. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 30 minuti iniettando continuamente una miscela di ossigeno al 95% e anidride carbonica al 5% nella provetta.

Quindi, trasferire l'arteria basilare dalla provetta due alla provetta tre e incubare. Trasferire un millilitro di soluzione di separazione cellulare preriscaldata dalla provetta uno alla provetta tre. Continuare a iniettare il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica mantenendo il trattamento enzimatico per tre minuti.

Triturare la preparazione dell'arteria basilare per rilasciare le cellule. Quindi, pipettare quattro millilitri di soluzione di separazione a freddo nella provetta tre per terminare il processo enzimatico. Centrifugare il composto a 59 g per sei minuti.

Con una pipetta, scartare il surnatante. Quindi aggiungere nuovamente la soluzione di separazione fredda. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il surnatante.

Lasciare un millilitro della sospensione cellulare. Conservare la sospensione cellulare a quattro gradi Celsius per sei-otto ore. Trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare in un bagno.

Aggiungere un millilitro di liquido extracellulare al bagno e lasciare riposare. Per iniziare, accendi una micropipetta polare. Posizionare un tubo di vetro nella polare.

Sul pannello di controllo selezionare il programma uno. Fare clic su Invio e accedere al programma uno. Ora esegui un test di rampa facendo clic su rampa sul pannello di controllo per misurare il valore termico del tubo di vetro.

Inserire un nuovo tubo di vetro. Quindi selezionare il programma uno e fare clic su invio per fabbricare la micropipetta. Per registrare la corrente di cura, avviare prima il software di acquisizione dati.

Selezionare il file, quindi fare clic su imposta nomi file di dati per stabilire un percorso di archiviazione dei dati. Abilitare la funzione di test della membrana nel menu degli strumenti. Posizionare un campione di cellule muscolari lisce isolate dall'arteria basilare di un ratto al centro della visuale della telecamera di un microscopio.

Immergere la punta del filo di riferimento nella soluzione del bagno. Quindi riempire il 20% della micropipetta fabbricata con la soluzione intracellulare. Fissare la micropipetta caricata sul supporto dell'elettrodo di registrazione.

Ora con una siringa, applicare una pressione positiva. Spostare la punta della pipetta nella soluzione del bagno e regolare l'offset della pipetta sul software dell'amplificatore di segnale per impostare la linea di base corrente su zero picoampere. Premere delicatamente la pipetta contro la membrana cellulare.

Osserva un aumento della resistenza delle foche ad almeno un magome. Rimuovere la pressione positiva e applicare una pressione negativa. Per stabilire un'elevata resistenza, con una resistenza di tenuta di almeno un giggome, impostare la tensione di mantenimento su meno 60 millivolt e compensare la capacità dell'elettrodo utilizzando CP FAST e CP slow.

Applicare una breve pressione negativa per rompere la membrana cellulare, formando un'intera configurazione cellulare. Selezionare l'intera cella nel software dell'amplificatore di segnale. Quindi fare clic su auto per la compensazione della capacità della membrana.

Caricare il protocollo kir e iniziare la registrazione dei dati. Sono state isolate cellule muscolari lisce appena isolate con morfologia a fuso. Le cellule erano sane e adatte per esperimenti di patch clamp.

Una tipica corrente di polimerizzazione ha mostrato una rettifica verso l'interno a tensioni negative con un flusso minimo o nullo di corrente di ioni potassio a tensioni positive. Il cloruro di bario a concentrazioni da 100 a 300 micromoli per litro ha inibito efficacemente l'attività del canale kir, confermando la corrente come kir. Il nitroprussiato di sodio ha aumentato la corrente di kir, indicando il ruolo dei canali kir nella vasodilatazione indotta da SNP.

Il confronto delle relazioni di tensione di corrente ha dimostrato una diminuzione della densità di corrente in presenza di cloruro di bario e un aumento con SNP.