Analisi della citometria di massa delle risposte immunitarie sistemiche e locali nel carcinoma epatocellulare

La citometria di massa ci permette di analizzare sia le risposte immunitarie sistematiche che quelle locali nel carcinoma epatocellulare. Profilando le cellule immunitarie a livello di singola cellula, identifichiamo sottogruppi unici e gli stati funzionali legati alla progressione del tumore, offrendo approfondimenti sui meccanismi di evasione immunitaria e sui potenziali bersagli terapeutici per trattamenti personalizzati. Il nostro protocollo utilizza la citometria di massa per analizzare oltre 14 marcatori contemporaneamente a livello di singola cellula, evitando la sovrapposizione spettrale osservata nella citometria a flusso tradizionale. Ciò comporta l'identificazione precisa delle popolazioni cellulari reali e fornisce dati ad alta dimensione per la profilazione immunitaria dettagliata e la scoperta di biomarcatori.

[Narratore] Per iniziare, scongelare la cellula mononucleata del sangue periferico congelata e le sospensioni cellulari dell'epatocarcinoma. Dopo il recupero cellulare, risospendere le cellule in un millilitro di PBS senza calcio e magnesio. Aggiungere il cisplatino a una concentrazione finale di 0,5 micromolari, mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per due minuti. Per arrestare la reazione, centrifugare le provette a 500 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante, quindi aggiungere un millilitro di tampone di colorazione cellulare a ciascuna provetta. Dopo aver centrifugato nuovamente, scartare con cura il surnatante. Per eseguire il blocco del recettore FC, preparare innanzitutto una miscela di blocchi da 50 microlitri per ciascun campione, combinare 48 microlitri di tampone di colorazione cellulare con due microlitri di soluzione bloccante FC. Risospendere il pellet di cella nella miscela a blocchi e incubare. Quindi, aggiungere 1,1 microlitri di ciascun anticorpo per campione in una provetta etichettata per preparare la miscela di anticorpi proteici di membrana. Portare il volume a 55 microlitri con tampone per la colorazione cellulare. Trasferire 50 microlitri della miscela di anticorpi preparata in ciascuna provetta del campione, portando il volume totale a 100 microlitri. Quindi agitare delicatamente i campioni per mescolarli prima di incubarli a temperatura ambiente per 15 minuti. Aggiungere un millilitro di tampone di colorazione cellulare a ciascuna provetta del campione. Centrifugare a 500 g per cinque minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Dopo il lavaggio finale, agitare brevemente il liquido rimanente con il pellet della cella per risospendere completamente le cellule. Per la colorazione delle proteine del nucleo, aggiungere 500 microlitri della soluzione di fissazione mista alle cellule risospese. Mescolare delicatamente i campioni prima di incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare a 500 G per cinque minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Quindi, pipettare 1000 microlitri di tampone di permeabilizzazione in ciascuna provetta per lavare le cellule. Quindi centrifugare le provette a 1000 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 50 microlitri della miscela di anticorpi in ogni provetta dopo aver scartato il surnatante. Pipettare delicatamente le cellule in modo da mescolarle accuratamente prima di incubarle. Quindi, pipettare 1000 microlitri di tampone di permeabilizzazione in ciascuna provetta, centrifugare di nuovo, quindi scartare il surnatante. Per fissare le cellule, aggiungere un millilitro di formaldeide all'1,6% preparata in PBS in ciascuna provetta del campione e agitare per mescolare accuratamente il contenuto. Dopo l'incubazione a temperatura ambiente per 10 minuti, centrifugare i campioni e scartare il surnatante. Per la colorazione dell'intercalazione nucleare, diluire prima l'intercalatore Cell-ID Iridium con tampone di fissazione e permeabilizzazione. Pipettare un millilitro della soluzione di intercalazione in ciascun campione. Mescolare delicatamente e vorticare. Posizionare i campioni a quattro gradi Celsius per una notte, quindi centrifugare come prima. Al termine dell'incubazione, pipettare 1000 microlitri di tampone per la colorazione cellulare nella provetta. Centrifugare le provette a 800 G per cinque minuti ed eliminare il surnatante. Infine, risospendere le cellule in 450-900 microlitri di acqua deionizzata. Colorare le cellule con il blu di tripano per il conteggio delle cellule prima di ulteriori analisi. Per iniziare, accendi il citometro di massa e avvia il programma. Analizzare i campioni nel sistema CyTOF e acquisire i dati citometrici di massa delle cellule mononucleate del sangue periferico e dei campioni di cellule di epatocarcinoma. Avviare il software di elaborazione dati sullo strumento e pre-elaborare la popolazione cellulare CD45+ nel file FCS. Quindi, eliminare le cellule morte utilizzando la colorazione di vitalità, come l'esclusione del cisplatino. Gate la popolazione CD45+ per concentrarsi sulle cellule immunitarie ed esportare la popolazione gated per ulteriori analisi. Trasforma i dati con un cofattore di cinque. Successivamente, avvia il software di clustering e identifica i cluster principali in base all'algoritmo SPADE, raggruppando le celle con profili di espressione dei marcatori simili in cluster. Applicare l'incorporamento gerarchico stocastico dei vicini, o HSNE, per la riduzione della dimensionalità e l'identificazione di cluster distinti. Quindi utilizzare il pacchetto del kit CyTOF nel nostro software per eseguire il re-clustering dei cluster principali. Utilizza il programma PhenoGraph per identificare i sotto-cluster con parametri predefiniti. Un totale di 14 tipi di cellule distinte sono stati identificati nei campioni di cellule mononucleate del sangue periferico. I modelli di espressione dei marcatori per ciascuno dei 14 tipi di cellule sono stati dettagliati nella mappa di calore, mostrando profili di espressione unici per popolazioni cellulari distinte. La distribuzione di questi tipi di cellule variava tra i campioni, con il campione D che presentava una percentuale più elevata di cellule T CD4, i campioni A e B che mostravano un arricchimento significativo di cellule B e CD141+, cellule dendritiche convenzionali, prevalentemente presenti nel campione C. Nei campioni di tessuto sono stati identificati otto tipi di cellule, tra cui monociti, cellule T, neutrofili, cellule natural killer, Cellule B, cellule dendritiche plasmacitoidi, eosinofili e cellule dendritiche mieloidi. I profili di espressione dei marcatori per i tipi di cellule tissutali indicano modelli distinti per ciascuna popolazione cellulare. I campioni di tessuto hanno mostrato una proporzione coerente di tipi di cellule in tutti i pazienti, riflettendo le caratteristiche immunologiche condivise con il carcinoma epatocellulare.