Isolamento dei microrganismi del suolo con la tecnologia iChip

Stiamo cercando di scoprire nuovi tipi di chimica per combattere i patogeni agricoli. Utilizzando la tecnologia iChip, abbiamo isolato nuovi organismi, che speriamo portino a una nuova chimica. La sperimentazione di questi organismi e/o dei loro prodotti naturali contro i patogeni agricoli può portare alla scoperta di nuovi organismi e/o composti candidati ai biopesticidi.

Il metodo iChip ci consente di isolare microrganismi che non sono coltivabili in condizioni convenzionali fornendo un periodo di addomesticamento e contatto con il loro ambiente naturale. La nostra struttura iChip modificata è semplice, economica e riduce il rischio di contaminazione microbica, rendendola facilmente accessibile per una varietà di obiettivi di ricerca. I risultati del nostro iChip aprono domande come quali meccanismi guidano la soppressione dei patogeni da parte di nuovi microbi?

Questi composti bioattivi possono funzionare in modo affidabile negli studi del mondo reale? In che modo i fattori ambientali influenzano la loro efficacia? Affrontare queste domande guiderà lo sviluppo sostenibile di biopesticidi, trasformando la gestione delle malattie delle piante e riducendo la dipendenza dai fungicidi sintetici.

Il laboratorio applicherà la tecnologia iChip per isolare nuovi batteri da terreni che sopprimono le malattie prodotti attraverso il cover cropping, identificando nuovi microbi e composti bioattivi. Questi saranno testati in studi controllati sulle malattie delle piante per sviluppare alternative innovative e sostenibili ai fungicidi sintetici per la gestione delle malattie agricole. Per costruire un iChip modificato utilizzando un punzone per agar da 5 millimetri, rimuovere il fondo dei pozzetti da una piastra a 96 pozzetti.

Tagliare membrane in policarbonato da 0,05 micrometri in rettangoli, assicurandosi che le dimensioni corrispondano all'area inferiore di una piastra a 96 pozzetti. Applicare un sigillante siliconico per far aderire la membrana in policarbonato al fondo della piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi che l'adesivo sigilli i pozzetti ma non copra completamente le aperture dei pozzetti.

Lasciare asciugare le piastre per 24 ore. Aggiungere 4,5 millilitri di acqua sterile a ciascuna delle provette da centrifuga da 15 millilitri etichettate da A a D e a ciascuna delle provette da 50 millilitri etichettate da E a H.Aggiungere 1 grammo di terreno in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Quindi aggiungere 10 millilitri di acqua al tubo e agitare la miscela per 10 minuti.

Lasciare riposare la sospensione del terreno per 10 minuti. Quindi, pipettare 0,5 millilitri di surnatante del terreno nella provetta A e mescolare accuratamente. Ora, trasferire 0,5 millilitri di sospensione cellulare dal tubo A al tubo B e mescolare accuratamente.

Ripetere l'operazione per tutte le provette da centrifuga rimanenti, completando una serie di diluizioni di dieci volte nelle otto provette. Per iniziare, immergi completamente gli iChip in etanolo al 95%. Dopo 15 minuti, rimuovere le piastre dall'etanolo e posizionarle su un tovagliolo di carta sterile nella cappa a flusso laminare.

Lasciare evaporare l'etanolo mentre si accende lo sterilizzatore a raggi ultravioletti nella cappa a flusso laminare per 15 minuti. Pipettare 360 microlitri di sali minimi succinati sterili o terreni SMS nella prima colonna della piastra per fungere da controllo. Aggiungere 45 millilitri di SMS alla sospensione cellulare in provetta E.Mescolare accuratamente per combinare la sospensione cellulare con l'agar.

Pipettare 360 microlitri della miscela di cellule di agar in tutti i pozzetti rimanenti della piastra a 96 pozzetti. Una volta che il terreno è solidificato, sigillare la parte superiore della piastra con un coperchio per PCR. Riempire le piastre con le provette F, G e H per preparare un totale di quattro piastre con differenze di concentrazione decuplicate.

Metti le piastre in un contenitore contenente circa 1 pollice di terreno con il lato della membrana rivolto verso il basso. Incubare le piastre all'interno del contenitore coperto al buio a 25 gradi Celsius. Dopo sei settimane, esamina gli iChip per la crescita microbica.

Sciacquare l'iChip modificato tre volte con acqua sterile per rimuovere tutte le particelle di terreno. Pulire la parte superiore e i lati della piastra con etanolo al 95%, evitando il lato con la membrana semipermeabile. Usando una lama sterile, tagliare il coperchio della piastra attorno a un pozzetto contenente una colonia e rimuovere il quadrato con una pinzetta sterile.

Utilizzando uno strumento sterile per striature, forare la colonia e striare sulla piastra di agar SMS con il metodo a quattro quadranti. Incubare le piastre a 25 gradi Celsius per una settimana o fino a quando non si osserva la crescita della colonia. Dopo l'incubazione, esaminare le colonie per confermare l'isolamento delle culture.