Visualizzazione 3D dei periciti vascolari retinici nei topi mediante immunocolorazione

Lo scopo di questa ricerca è quello di studiare la morfologia e la distribuzione spaziale dei parassiti nel sistema vascolare retinico utilizzando tecniche avanzate di imaging. Al fine di fornire una visione dettagliata per dimostrare le caratteristiche morfologiche dei parassiti, lo studio ha descritto un nuovo approccio che combina l'iniezione retroorbitale di agente fluorescente, la colorazione immunofluorescente e il trattamento di pulizia dei tessuti per far progredire la ricerca nel nostro campo.

Rispetto allo stato di pre-clearing del tessuto retinico di topo, i segnali di fondo dei vasi sanguigni e dei parassiti marcati con lattina di pomodoro fluorescente e PDGFR-beta sono significativamente ridotti dopo la clearing dei tessuti, facilitando un'osservazione più precisa della loro relazione spaziale.

I nostri risultati indicano che queste tecniche sono altamente compatibili per dimostrare la presenza di parassiti nel sistema vascolare retinico nell'intera retina montata. La combinazione di queste tecniche istologiche è un approccio efficace per visualizzare in dettaglio le caratteristiche morfologiche dei parassiti da una vista tridimensionale.

[Istruttore] Per iniziare, posizionare il topo anestetizzato nella decubita laterale destra con la testa rivolta a sinistra. Premere delicatamente due dita sull'area periorbitale per esporre l'occhio sinistro del mouse. Utilizzando una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 27, perforare delicatamente circa due o tre millimetri nel seno venoso orbitale, assicurandosi che lo smusso dell'ago sia rivolto in avanti con un angolo di 45 gradi. Iniettare 0,1 millilitri di lattina di pomodoro fluorescente nel seno venoso orbitale. Dopo cinque minuti di iniezione retroorbitale, sopprimere il topo e utilizzare le forbici chirurgiche per aprire la cavità toracica. Inserire un ago calibro 24 da due millimetri nel ventricolo cardiaco sinistro attraverso l'apice ventricolare sinistro. Eseguire la perfusione a una velocità di tre millilitri al minuto con 20 millilitri di soluzione fisiologica allo 0,9%, seguiti da 20 millilitri di soluzione fisiologica al 4%. Iniettare 0,1 millilitri di formaldeide allo 0,9% in tampone fosfato molare da 0,1 molari. Quindi, posiziona il topo sacrificato su un lato e rimuovi la pelle coprendo gli occhi con le forbici. Enuclea gli occhi con forbici e pinze. Taglia il nervo ottico e i tessuti circostanti e solleva l'occhio. Trasferire l'occhio su una piastra a 12 pozzetti per il fissaggio in formaldeide al 4% in tampone fosfato molare 0,1 molare per due ore. Dopo il fissaggio, crioproteggere l'occhio con saccarosio al 25% in tampone fosfato molare 0,1 molare a quattro gradi Celsius fino a quando non affonda sul fondo della soluzione. Utilizzando una pipetta di plastica per pastori, trasferire l'occhio in una capsula di Petri contenente 0,1 tampone fosfato molare. Forare il bordo della cornea con forbici affilate, tagliare intorno alla cornea e all'iride e scartarle. Usando il forcipe, rimuovere il cristallino e l'umor vitreo. Quindi, usa una pinza sottile per allontanare la retina a forma di coppa dal centro dell'occhio. Sciacquare la retina con tampone fosfato molare 0,1 in una capsula di Petri pulita. Dopo aver isolato la retina di topo a forma di coppa, incubarla in un'incubatrice di 20 ore con una soluzione di Triton X-100 al 2% in tampone fosfato molare 0,1 molare per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire la retina nella soluzione bloccante e ruotare a 72 giri/min sullo shaker durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi, posizionare la retina in una provetta da microcentrifuga contenente gli anticorpi primari della capra anti-PDGFR beta in tampone di diluizione. Ruotare il tubo sullo shaker per due giorni a quattro gradi Celsius. Dopo due giorni, lavare la retina due volte con un tampone di lavaggio a temperatura ambiente. Posizionare la retina nel tampone di lavaggio e trasferirla nell'agitatore per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire la retina in una provetta da microcentrifuga contenente una soluzione di un milligrammo per millilitro di anticorpo secondario di asino anti-capra 488 e 0,2 nanogrammi per millilitro di colorante nucleare fluorescente DAPI. Ruotare il tubo sullo shaker a 72 giri/min per cinque ore a quattro gradi Celsius. Lavare la retina in una piastra a sei pozzetti con tampone di lavaggio per un'ora due volte a temperatura ambiente. Incubare la retina nel tampone di lavaggio sull'agitatore per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire la retina nel reagente per la pulizia dei tessuti e ruotarla delicatamente sull'agitatore a 60 giri/min per un'ora a 37 gradi Celsius. Dopo la pulizia dei tessuti, sciacquare la retina con tampone fosfato molare 0,1 in una capsula di Petri pulita. Usando le forbici a molla, fai quattro incisioni radiali che raggiungono circa 2/3 del raggio della retina per creare una forma a petalo. Appiattire la retina e montarla su un vetrino da microscopio con l'interno della retina rivolto verso l'alto. Utilizzare un piccolo pezzo di carta assorbente per rimuovere il tampone fosfato in eccesso. Circondare la retina montata con un distanziatore. Riempire lo spazio vuoto con un reagente fresco per la pulizia dei tessuti e posizionare sopra un vetrino coprioggetti. Scansiona le viste di montaggio della retina etichettata utilizzando lo scanner panoramico per fette di tessuto. Scatta le immagini con ingrandimento più elevato utilizzando un sistema di imaging dotato di un obiettivo 2X e 10X con aperture numeriche rispettivamente di 0,40 e 0,95. Cattura immagini stack 50Z dalla retina etichettata in due fotogrammi micrometrici. Fare clic in sequenza su Imposta piano focale iniziale, Imposta piano focale finale, Imposta dimensione passo, scegliere Modello profondità, Acquisizione immagine e Serie Z per integrare tutte le immagini in un'unica immagine a fuoco utilizzando la modalità di proiezione e topografia. Successivamente, acquisisci immagini utilizzando la fluorescenza verde a 499 e 519 nanometri, la fluorescenza rossa a 591 e 618 nanometri e la fluorescenza blu a 401 e 421 nanometri. Seleziona in sequenza Aggiungi nuove superfici, scegli Impostazioni volume, scegli Canale sorgente, regola la visualizzazione, regola l'angolo della superficie e crea un'istantanea per importare le immagini confocali Z-Stack nel software di analisi e ricostruire le immagini nel modello tridimensionale. La trasparenza tissutale dell'intera retina monta è stata aumentata dopo il trattamento di pulizia dei tessuti rispetto alla retina senza pulizia dei tessuti. La vascolarizzazione retinica marcata con lectina di pomodoro e i parassiti retinici marcati con PDGFR-β erano visibili sia prima che dopo la pulizia dei tessuti, ma il rumore di fondo è stato ridotto dopo la pulizia dei tessuti. Parassiti retinici sono stati osservati lungo l'albero vascolare, mostrando una distribuzione graduale dalle regioni centrali a quelle periferiche della retina. Le immagini tridimensionali Z-Stack della retina ripulita hanno mostrato parassiti strettamente avvolti attorno a vasi retinici di vari diametri con una colorazione più forte di PDGFR-β nei capillari.