Name: Isolamento enzimatico delle vescicole extracellulari interstiziali del muscolo scheletrico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Scopri l'isolamento enzimatico delle vescicole extracellulari interstiziali del muscolo scheletrico in modelli roditore. Questo metodo standardizzato consente di ottenere vescicole ad alta purezza per studiare l'omeostasi muscolare e le malattie neuromuscolari.

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<meta charset="utf8"></head><body>Isolamento ottimizzato delle vescicole extracellulari derivate dal muscolo scheletrico per la ricerca e la terapia

<ol><li>Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+ultrasound+promotes+secretion+of+anti-inflammatory+extracellular+vesicles+from+skeletal+myotubes+via+elevation+of+intracellular+calcium+level%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pulsed ultrasound promotes secretion of anti-inflammatory extracellular vesicles from skeletal myotubes via elevation of intracellular calcium level.</a> Elife. 12, 89512(2023).</li>
<li>Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+myotube-derived+extracellular+vesicles+enhance+itaconate+production+and+attenuate+inflammatory+responses+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skeletal myotube-derived extracellular vesicles enhance itaconate production and attenuate inflammatory responses of macrophages.</a> Front Immunol. 14, 1099799(2023).</li>
<li>Takada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-%CE%B1+blunts+the+osteogenic+effects+of+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles+by+affecting+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-α blunts the osteogenic effects of muscle cell-derived extracellular vesicles by affecting muscle cells.</a> Calcif Tissue Int. 112 (3), 377-388 (2023).</li>
<li>Bourgeois, B. L., Levitt, D. E., Molina, P. E., Simon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+adipocyte+and+myotube+extracellular+vesicle+miRNA+cargo+in+chronic+binge+alcohol-administered+siv-infected+male+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of adipocyte and myotube extracellular vesicle miRNA cargo in chronic binge alcohol-administered siv-infected male macaques.</a> Alcohol. 108, 1-9 (2023).</li>
<li>Kargl, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+potential+of+skeletal+muscle+derived+extracellular+vesicles+differs+between+oxidative+and+glycolytic+muscle+tissue+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Angiogenic potential of skeletal muscle derived extracellular vesicles differs between oxidative and glycolytic muscle tissue in mice.</a> Sci Rep. 13 (1), 18943(2023).</li>
<li>Vann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+microRNA+profiles+of+intramuscular+and+secreted+extracellular+vesicles+in+human+tissue-engineered+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential microRNA profiles of intramuscular and secreted extracellular vesicles in human tissue-engineered muscle.</a> Front Physiol. 13, 937899(2022).</li>
<li>Anakor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+vesicles+secreted+by+als+patient+myotubes+is+specific+to+exosome-like+and+not+larger+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of vesicles secreted by als patient myotubes is specific to exosome-like and not larger subtypes.</a> Cells. 11 (5), 845(2022).</li>
<li>Mendhe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+extracellular+vesicles+from+adipose-derived+stem+cells+increase+muscle+reperfusion+but+degrade+muscle+structural+proteins+in+a+mouse+model+of+hindlimb+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Lyophilized extracellular vesicles from adipose-derived stem cells increase muscle reperfusion but degrade muscle structural proteins in a mouse model of hindlimb ischemia-reperfusion injury.</a> Cells. 12 (4), 557(2023).</li>
<li>Madison, R. D., Robinson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-derived+extracellular+vesicles+influence+motor+neuron+regeneration+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Muscle-derived extracellular vesicles influence motor neuron regeneration accuracy.</a> Neuroscience. 419, 46-59 (2019).</li>
<li>Hanson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EV-mediated+promotion+of+myogenic+differentiation+is+dependent+on+dose%2C+collection+medium%2C+and+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">EV-mediated promotion of myogenic differentiation is dependent on dose, collection medium, and isolation method.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 33, 511-528 (2023).</li>
<li>Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., De Morrée, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+quiescent+stem+cell+populations+from+individual+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles.</a> J Vis Exp. 190, e64557(2022).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28misev2018%29%3A+A+position+statement+of+the+international+society+for+extracellular+vesicles+and+update+of+the+misev2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28misev2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+proteomics+argues+against+a+general+role+for+CD9%2C+CD81+or+CD63+in+the+sorting+of+proteins+into+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Differential proteomics argues against a general role for CD9, CD81 or CD63 in the sorting of proteins into extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 12 (8), e12352(2023).</li>
<li>Baietti, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-syntenin-Alix+regulates+the+biogenesis+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Syndecan-syntenin-Alix regulates the biogenesis of exosomes.</a> Nat Cell Biol. 14 (7), 677-685 (2012).</li>
<li>Shanely, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+biopsy+procedures+using+the+modified+bergstr%C3%B6m+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified bergström technique.</a> J Vis Exp. (91), e51812(2014).</li>
<li>Mousavi, K., Miranda, W., Parry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+factors+enhance+the+survival+of+muscle+fibers+in+edl%2C+but+not+sol%2C+after+neonatal+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic factors enhance the survival of muscle fibers in edl, but not sol, after neonatal nerve injury.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 283 (3), C950-C959 (2002).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Ishii, K., Suzuki, N., Mabuchi, Y., Sekiya, I., Akazawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+advantage+of+recombinant+collagenase+for+isolation+of+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Technical advantage of recombinant collagenase for isolation of muscle stem cells.</a> Regen Ther. 7, 1-7 (2017).</li>
<li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> J Vis Exp. (86), e50846(2014).</li>
<li>Mozzetta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of muscle stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1480, 311-322 (2016).</li>
<li>Clemens, Z., Wang, K., Ambrosio, F., Barchowsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+disrupts+extracellular+vesicle-mediated+signaling+in+regenerating+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Arsenic disrupts extracellular vesicle-mediated signaling in regenerating myofibers.</a> Toxicol Sci. 195 (2), 231-245 (2023).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle-derived+extracellular+vesicles+transport+glycolytic+enzymes+to+mediate+muscle-to-bone+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle-derived extracellular vesicles transport glycolytic enzymes to mediate muscle-to-bone crosstalk.</a> Cell Metab. 35 (11), 2028-2043.e7 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Provette per microcentrifuga da 0,6 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>microprovetta da 1,5 mL (C)&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5720411009</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3448</td> Siringa BD da 5 mL <td>trasparente, graduata, non sterile</td></tr><tr><td></td><td>Becton Dickinson</td><td>14-827-52&nbsp;</td><td>Punta Luer-Lok</td></tr><tr><td>Vetrini contacellulare, doppia camera per contatore cellulare</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>22620667</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione detergente</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi II</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x) Liquido (-calcio,-magnesio)</td><td>Cytiva</td><td>SH30378.02</td><td>La diluizione finale utilizzata è 1x</td></tr><tr><td>DPBS/Modified (1x)</td><td>Cytiva</td><td>SH30264.02</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td></td></tr><tr><td>E-POD Pure Dispenser remoto d'acqua</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZRXSP0D01</td><td></td></tr><tr><td>FA-45-30-11 Rotore per microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>05-401-503</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Flow NanoAnalyzer NanoFCM</td><td>Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heratherm OGS60 Protocollo generale Forno</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51028112</td><td>convezione gravitazionale, 2,3 piedi cubi 120 V</td></tr><tr><td>MemGlow-488</td><td>Sonda citoscheletro Inc.</td><td>MG01-02</td><td></td></tr><tr><td>Millipak Millipore Special Millipore</td><td>Sigma</td><td>TANKMPK02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipetta L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipetta L-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipetta L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette ER LTS 1000&micro; L F 768G/8</td><td>Rainin</td><td>30808038</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette ER LTS 20&micro; L F 960G/10</td><td>Rainin</td><td>30807966</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette ER LTS 200&micro; L F 960G/10</td><td>Rainin</td><td>30807967</td><td></td></tr><tr><td>perline per il controllo di qualità</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S110-AT Rotore ad angolo fisso</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45539</td><td>1,10,000 giri/min</td></tr><tr><td>S16 exo 65-155nm perline</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>SPI, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall mX 150+ Micro-Ultracentrifuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50135641</td><td></td></tr><tr><td>TC 20 contatore di cellule automatizzato</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Pinzette Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SPI, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vwr 15mL provette per centrifuga</td><td>Avantor</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Puradisc 13 Filtri</td><td>Cytiva</td><td>6782-1304</td><td>0.45 &micro; m dimensione dei pori</td></tr><tr><td>Topi Wild-type C57BL/6J</td> Jackson <td>Laboratory</td><td>stock #000664</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento enzimatico delle vescicole extracellulari interstiziali del muscolo scheletrico

Enzymatic Isolation of Skeletal Muscle Interstitial Extracellular Vesicles

Seguendo questo protocollo, le vescicole extracellulari del muscolo scheletrico (SkM-EV) sono state estratte con successo da vari gruppi muscolari, tra cui il tibiale anteriore (TA), l'estensore lungo delle dita (EDL), il soleo (SOL), il gastrocnemio (GAS) e il quadricipite (QUA) da topi wild-type. La successiva caratterizzazione di queste SkM-EV è stata condotta attraverso la citometria a nanoflusso, chiarendo le loro caratteristiche distintive come riassunto nella Tabella 1. Sorprendentemente, da un so...

Isolamento enzimatico delle vescicole extracellulari interstiziali del muscolo scheletrico

Extracellular vesicles (EVs) are lipid bilayer-enclosed nanoparticles released by cells to transport bioactive cargo, such as proteins, RNAs, and DNAs, ...

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L'isolamento e la cultura della miofibre è il gold...

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

I vasi sanguigni all'interno del porto muscolo scheletrico diverse popolazioni precursori multi-lignaggio umane che sono ideali per applicazioni rigenerative. Questo metodo di isolamento permette la purificazione simultanea di tre popolazioni di cellule precursori multipotenti rispettivamente da tre strati strutturali dei vasi sanguigni: cellule endoteliali da miogenici intima, periciti dai media, e le cellule avventiziali da avventizia.

Isolamento dei vasi sanguigni derivati ​​da Multipotent precursori del muscolo scheletrico umano

I principali tipi di cellule aderenti derivati dal muscolo umano sono le cellule miogeniche e i fibroblasti. Qui, le popolazioni cellulari vengono arricchite utilizzando lo smistamento cellulare attivato magneticamente basato sull'antigene CD56. La successiva immunomarcatura con anticorpi specifici e l'uso di tecniche di analisi delle immagini consentono la quantificazione delle caratteristiche citoplasmatiche e nucleari nelle singole cellule.

Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

Cellule endoteliali microvascolari dei muscoli scheletrici (MMEC) forma la parete interna dei vasi capillari del muscolo e regolano entrambi, scambio di fluidi/molecole e migrazione delle cellule (immuni) tra sangue e tessuto muscolare. Isolamento di MMEC murino primario, come descritto qui, consente indagini complete in vitro del "unità myovascular".

Isolamento di cellule endoteliali microvascolari murino primario del muscolo scheletrico

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per isolare piccole vescicole extracellulari (SVE) dai tessuti interi, compresi i campioni di cervello e del tumore. Questo metodo offre una tecnica riproducibile per estrarre SVE da tessuto solido per ulteriori analisi a valle.

Estrazione delle vescicole extracellulari dal tessuto intero

Questo protocollo illustra 1) l'isolamento e la coltura di fibroblasti primari dal muscolo gastrocnemio di topo adulto e 2) la purificazione e la caratterizzazione degli esosomi utilizzando un metodo di ultracentrifugazione differenziale combinato con gradienti di densità del saccarosio seguito da analisi western blot.

Isolamento e caratterizzazione di esosomi da fibroblasti muscolari scheletrici

Qui descriviamo l'arricchimento di piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato attraverso un metodo di ultracentrifugazione differenziale ottimizzato.

Un metodo di arricchimento per piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato

Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule staminali muscolari e dei progenitori fibro-adipogeni dai singoli muscoli scheletrici nei topi. Il protocollo prevede la dissezione di un singolo muscolo, l'isolamento delle cellule staminali mediante selezione cellulare attivata a fluorescenza, la valutazione della purezza mediante colorazione con immunofluorescenza e la misurazione quantitativa dell'ingresso in fase S mediante saggio di incorporazione di 5-etinil-2'-deossiuridina.

Isolamento di popolazioni di cellule staminali quiescenti da singoli muscoli scheletrici

Questo protocollo fornisce un metodo standardizzato per isolare e arricchire mioblasti primari da muscoli scheletrici di topo adulti e neonati attraverso dissociazione tissutale, filtrazione sequenziale, preplaccatura e condizioni di coltura definite, consentendo l'istituzione e il mantenimento di colture mioblastiche derivate da cellule satellitari per applicazioni sperimentali a valle.

Isolamento delle cellule satelliti muscolari scheletrici per studi in vitro sulla miogenesi

Questo protocollo descrive l'isolamento delle singole fibre muscolari intate dal soleo ossidativo e l'istituzione di colture mioblastiche altamente purificate derivate da queste fibre. La procedura ottimizzata fornisce in modo affidabile circa 300–500 miofibre intatte per topo, permettendo analisi molecolari e cellulari a valle.

Saggio di isolamento a fibra singola per la valutazione del comportamento ossidativo delle miofibre

Questo protocollo descrive l'isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscoli scheletrici murini e midollo osseo tramite digestione enzimatica e cromatografia a esclusione di dimensioni, consentendo il recupero riproducibile di frazioni arricchite da vescicole da tessuti strutturalmente complessi e a basso rendimento per l'analisi molecolare a valle.

Isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscolo scheletrico murino e midollo osseo tramite cromatografia a esclusione di dimensioni

Scopri l'isolamento enzimatico delle vescicole extracellulari interstiziali del muscolo scheletrico in modelli roditore. Questo metodo standardizzato consente di ottenere vescicole ad alta purezza per studiare l'omeostasi muscolare e le malattie neuromuscolari.

Isolamento enzimatico delle vescicole extracellulari interstiziali del muscolo scheletrico

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