Name: Sviluppo di un sistema di protoplasti di cavolo per lo studio della tolleranza allipossia nelle brassicacee (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Scopri lo sviluppo di un sistema di protoplasti di cavolo per studiare la tolleranza all'ipossia nelle brassicacee. Questo metodo permette di analizzare i meccanismi molecolari della risposta allo stress da allagamento.

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<meta charset="utf8"></head><body>Efficiente sistema di protoplasto per cavoli per lo studio dei meccanismi di tolleranza alle inondazioni

<ol><li>Tanoue, M., Hirabayashi, Y., Ikeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global-scale+river+flood+in+the+last+50+years%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Global-scale river flood in the last 50 years.</a> Sci Rep. 6 (1), 36021(2016).</li>
<li>Voesenek, L. aC. J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flood+adaptive+traits+and+processes%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Flood adaptive traits and processes: An overview.</a> New Phytol. 206 (1), 57-73 (2015).</li>
<li>Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+in+maize+and+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 127 (4), 1466-1475 (2001).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+transient+protoplast+system+for+analyzing+defense+gene+expression+and+protein-protein+interactions+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">A highly efficient transient protoplast system for analyzing defense gene expression and protein-protein interactions in rice.</a> Mol Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).</li>
<li>Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+A+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protoplast+isolation%2C+transformation%2C+and+its+application+in+sugarcane+%28Saccharum+spontaneum+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+J%22%5BJournal%5D)">Optimization of protoplast isolation, transformation, and its application in sugarcane (Saccharum spontaneum L).</a> Crop J. 9 (1), 133-142 (2021).</li>
<li>Adedeji, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protocol+for+efficient+protoplast+isolation+and+transient+gene+expression+in+carnation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Hortic%22%5BJournal%5D)">Optimization of protocol for efficient protoplast isolation and transient gene expression in carnation.</a> Sci Hortic. 299, 111057(2022).</li>
<li>Lin, H. -Y., Chen, J. -C., Fang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protoplast+transient+expression+system+to+enable+molecular%2C+cellular%2C+and+functional+studies+in+Phalaenopsis+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A protoplast transient expression system to enable molecular, cellular, and functional studies in Phalaenopsis orchids.</a> Front Plant Sci. 9, (2018).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+mesophyll+protoplast+isolation+and+PEG-mediated+transient+expression+system+in+eggplant%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Hortic%22%5BJournal%5D)">A highly efficient mesophyll protoplast isolation and PEG-mediated transient expression system in eggplant.</a> Sci Hortic. 304, 111303(2022).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+protoplast+isolation+system+for+functional+gene+expression+and+characterization+using+petals+of+Camellia+oleifera%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development of a protoplast isolation system for functional gene expression and characterization using petals of Camellia oleifera.</a> Plant Physiol Biochem. 201, 107885(2023).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+isolation+of+Populus+mesophyll+protoplasts+and+its+application+in+transient+expression+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Highly efficient isolation of Populus mesophyll protoplasts and its application in transient expression assays.</a> PLOS One. 7 (9), e44908(2012).</li>
<li>Gottschald, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIAR+and+TIA-1+mRNA-binding+proteins+co-aggregate+under+conditions+of+rapid+oxygen+decline+and+extreme+hypoxia+and+suppress+the+HIF-1%CE%B1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TIAR and TIA-1 mRNA-binding proteins co-aggregate under conditions of rapid oxygen decline and extreme hypoxia and suppress the HIF-1α pathway.</a> J Mol Cell Biol. 2 (6), 345-356 (2010).</li>
<li>Cho, H. -Y., Chou, M. -Y., Ho, H. -Y., Chen, W. -C., Shih, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+modulates+translation+dynamics+in+Arabidopsis+under+submergence+via+GCN2+and+EIN2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2.</a> Sci Adv. 8 (22), eadm7863(2022).</li>
<li>Boudreau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation+light+dose+engineering+to+reduce+photo-bleaching+and+photo-toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Excitation light dose engineering to reduce photo-bleaching and photo-toxicity.</a> Sci Rep. 6 (1), 30892(2016).</li>
<li>Shcherbakova, D. M., Cox Cammer, N., Huisman, T. M., Verkhusha, V. V., Hodgson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+multiplex+imaging+and+optogenetics+of+Rho+GTPases+enabled+by+near-infrared+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct multiplex imaging and optogenetics of Rho GTPases enabled by near-infrared FRET.</a> Nat Chem Biol. 14 (6), 591-600 (2018).</li>
<li>Jiang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+sulfite+is+a+potential+hypoxia+inducer+that+mimics+hypoxic+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Sodium sulfite is a potential hypoxia inducer that mimics hypoxic stress in Caenorhabditis elegans.</a> J Biol Inorg Chem. 16 (2), 267-274 (2011).</li>
<li>Lin, C. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUB1A-1+anchors+a+regulatory+cascade+for+epigenetic+and+transcriptional+controls+of+submergence+tolerance+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+Nexus%22%5BJournal%5D)">SUB1A-1 anchors a regulatory cascade for epigenetic and transcriptional controls of submergence tolerance in rice.</a> PNAS Nexus. 2 (7), pgad229(2023).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis-molybdopterin+guanine+dinucleotide+modulates+hemolysin+expression+under+anaerobiosis+and+contributes+to+fitness+in+vivo+in+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bis-molybdopterin guanine dinucleotide modulates hemolysin expression under anaerobiosis and contributes to fitness in vivo in uropathogenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 116 (4), 1216-1231 (2021).</li>
<li>Liu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+and+hypoxia-induced+gene+zmPORB1+determines+tocopherol+content+in+the+maize+kernel%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The light and hypoxia-induced gene zmPORB1 determines tocopherol content in the maize kernel.</a> Sci China Life Sci. 67 (3), 435-448 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Acido 2-(N-morfolino) etansolfonico (MES)</td><td>PhytoTech Labs</td><td>M825</td><td>Per la preparazione di soluzioni enzimatiche</td></tr><tr><td>228 semi di cavolo</td><td>Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Giappone)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50050</td><td>Per la preparazione di soluzioni enzimatiche</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>Alpha Plus</td><td>16106</td><td>Per l'incubazione di protoplasti</td></tr><tr><td>70 &mu; filtro cellulare m</td><td>Sorfa&nbsp;</td><td>SCS701</td><td>Per filtrazione protoplast</td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 9 cm</td><td>Alpha Plus</td><td>16001</td><td>Per digestione enzimatica</td></tr><tr><td>Barattolo anaerobico</td><td>HIMEDIA</td><td>Barattolo anaerobico 3,5 L</td><td>Per il trattamento dell'ipossia&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Per la preparazione della soluzione W5 e il rivestimento della piastra</td></tr><tr><td>di coltura Cloruro di calcio</td><td>J.T.Baker</td><td>131301</td><td>Per la preparazione della soluzione W5 e della soluzione PEG</td></tr><tr><td>Cellulasi R10</td><td>Yakult</td><td></td><td>Per la preparazione della soluzione enzimatica</td></tr><tr><td>Essiccatore</td><td>Tarsons&nbsp;</td><td>402030</td><td>Per l'infiltrazione sotto vuoto</td></tr><tr><td>D-Glucosio</td><td>Bioshop</td><td>GLU501</td><td>Per la preparazione della soluzione W5</td></tr><tr><td>Misuratore di ossigeno disciolto</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion Star A223</td><td>Per la misurazione dell'ossigeno</td></tr><tr><td>D-mannitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1902</td><td>Per la preparazione di soluzioni enzimatiche, soluzioni PEG e soluzioni MMG</td></tr><tr><td>Sistema di analisi reporter a doppia luciferasi</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Per il saggio reporter a doppia luciferasi</td></tr><tr><td>EC-Oxyrase</td><td>Oxyrase Inc.</td><td>EC-0005</td><td>Per il trattamento dell'ipossia</td></tr><tr><td>Semi di cavolo Fuyudori</td><td>Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Giappone)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Centrifuga refrigerata ad alta velocità</td><td>Hitachi</td><td>CR21GIII</td><td>Per la raccolta di protoplasti</td></tr><tr><td>Macerozyme R10&nbsp;</td><td>Yakult</td><td></td><td>Per la preparazione di soluzioni enzimatiche</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Alfa Aesar</td><td>12315</td><td>Per la preparazione di soluzioni MMG</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Hitachi</td><td>CT15RE</td><td>Per la raccolta di protoplasti</td></tr><tr><td>Microplate</td><td>Greiner</td><td>655075</td><td>Per test reporter a doppia luciferasi</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>SpectraMax Mini</td><td>Per Saggio reporter a doppia luciferasi</td></tr><tr><td>Millex 0.22 &mu; m filtro per siringa</td><td>Merck</td><td>SLGP033RS</td><td>Per la preparazione di soluzioni enzimatiche</td></tr><tr><td>Pompa a vuoto senza olio</td><td>Rocker&nbsp;</td><td>Rocker 300</td><td>Per infiltrazione sotto vuoto</td></tr><tr><td>OxyFluor Oxyrase</td><td>Inc.</td><td>OF-0005</td><td>Per il trattamento dell'ipossia</td></tr><tr><td>Pacchetto assorbitore di ossigeno</td><td>Mitsubishi Gas Chemical Company</td><td>AnaeroPack, MGCC1</td><td>Per il trattamento dell'ipossia</td></tr><tr><td>Concentratore di ossigeno</td><td>ULTIMATE PERFECT</td><td>AII-X</td><td>Per il gorgogliamento dell'ossigeno in soluzione W5</td></tr><tr><td>Substrato vegetale</td><td>Klasmann-Deilmann</td><td>Substrato Potgrond H</td><td>Per la preparazione di piantine di cavolo</td></tr><tr><td>Plasmid Midi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12145</td><td>Per la purificazione del DNA plasmidico di grado trasfezione&nbsp;</td></tr><tr><td>Polietilenglicole 4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td>Per la trasfezione di protoplasti</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>J.T.Baker</td><td>304001</td><td>Per la preparazione della soluzione W5</td></tr><tr><td>Lama di rasoio</td><td>Gillette</td><td></td><td>Per la preparazione di strisce di foglie di cavolo</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td></td><td>Bioshop SOD002</td><td>Per la preparazione della soluzione W5</td></tr><tr><td>Solfito di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td>Per il trattamento dell'ipossia</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Yihder</td><td>BU-240D</td><td>Per la preparazione della soluzione enzimatica</td></tr></tbody></table>

sviluppo di un sistema di protoplasti di cavolo per lo studio della tolleranza all'ipossia nelle brassicacee

Development of a Cabbage Protoplast System for Studying Hypoxia Tolerance in Brassica

Questo lavoro ha sviluppato con successo un sistema di espressione transitoria utilizzando protoplasti di cavolo (vedere la Figura 1 per il flusso di lavoro). I protoplasti sono stati isolati da foglie vere di cavolo di 2-3 settimane di dimensioni adeguate (Figura 2A) da cultivar di cavolo commerciali 'Fuyudori' e '228' utilizzando la digestione di cellulasi/macerozima e l'infiltrazione sotto vuoto scuro (Figura 2B, C). Per mitigare le condizioni di ipossia sperimentate dai protoplasti sommersi durante l'incubazione, la soluzione W5 è stata ossigenata utilizzando un gorgogliatore di pietre porose collegato a una macchina per l'ossigeno (Figura 2D). Questo processo ha aumentato significativamente la concentrazione di ossigeno disciolto nella soluzione W5 da 7,84 mg· L-1 ± 0,05 mg· L-1 a 29,18 mg· L-1 ± 0,43 mg· L-1 dopo 5 minuti di gorgogliare ossigeno. Dopo il processo di isolamento, la resa dei protoplasti è stata di 1,04 x 107 per 'Fuyudori' e di 4,00 x 106 protoplasti·g−1 peso fresco per '228' dopo un periodo di digestione notturna (Figura 2E). Successivamente, la GFP è stata utilizzata come gene reporter per valutare l'efficienza di trasformazione del metodo di trasfezione mediata da PEG, dimostrando che l'efficienza di trasfezione dei protoplasti nel cavolo era superiore al 40% in entrambe le cultivar (Figura 2F), confermando così la vitalità di questo sistema.
Inoltre, i costrutti promotori dei geni della risposta alla respirazione anaerobica del cavolo, i vettori BoADH1p::Luc e BoSUS1Lp::Luc (Figura 3A), sono stati introdotti nei protoplasti del cavolo come reporter per valutare gli effetti dell'induzione ipossica di diversi trattamenti. A questo sistema modello di espressione transitoria sono stati applicati anche vari trattamenti di regolazione dell'ossigeno. I risultati hanno mostrato che tutti i trattamenti di eliminazione dell'ossigeno, ad eccezione del solfito di sodio, hanno indotto con successo una risposta all'ipossia nei protoplasti di cavolo (Figura 3B). In particolare, l'attività del promotore di BoADH1 è aumentata di circa 2,6 volte e 3,2 volte rispetto al controllo dopo il trattamento con EC-Ossirasi e OxyFluor, rispettivamente, e, in particolare, di oltre 7,0 volte con il trattamento con pacchetto di assorbitori di ossigeno (Figura 3B). Allo stesso modo, l'attività del promotore di BoSUS1L è aumentata di circa 1,7 volte e 1,8 volte con il trattamento con EC-Ossirasi e OxyFluor, rispettivamente, mentre il trattamento con pacchetto di assorbitori di ossigeno ha indotto un aumento sostanziale di oltre 5,6 volte (Figura 3B). Questi risultati suggeriscono che il pacchetto di assorbimento dell'ossigeno dimostra un'efficacia superiore nella creazione di un ambiente ipossico in questo sistema sperimentale di protoplasti di cavolo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig01.jpg"> 
Figura 1: Rappresentazione grafica del flusso di lavoro di isolamento dei protoplasti. Questa figura illustra il processo graduale coinvolto nell'isolamento dei protoplasti dal tessuto delle foglie di cavolo. Il flusso di lavoro viene rappresentato visivamente per fornire una chiara comprensione della procedura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig02v2.jpg"> 
Figura 2: Isolamento dei protoplasti dal tessuto fogliare del cavolo. (A) Viene mostrato l'aspetto delle varietà commerciali di cavolo 'Fuyudori' e '228' allo stadio di crescita raccomandato. Le seconde foglie vere completamente espanse (indicate dalla punta di freccia) dei cavoli nello stadio a 2 foglie vengono selezionate per l'isolamento dei protoplasti. Barra di scala: 2 cm. (B) Una pompa a vuoto e un essiccatore sono impiegati per il processo di infiltrazione sottovuoto di strisce di foglie di cavolo, con un'infiltrazione di 30 minuti eseguita prima della digestione enzimatica. (C) Viene illustrata la condizione delle strisce di foglie di cavolo durante la digestione enzimatica. La digestione completa del tessuto fogliare richiede un totale di 4-16 ore. Barra di scala: 3 cm. (D) Le foto mostrano l'uso di un concentratore di ossigeno collegato a una pietra porosa per aumentare la concentrazione di ossigeno disciolto nella soluzione W5. Barra della scala: 5 cm. (E) Oltre 4,00 x 106 protoplasti mesofilli per grammo di peso fresco (FW) sono stati ottenuti da entrambe le varietà di cavoli 'Fuyudori' e '228' e sono stati osservati al microscopio. Barra della scala: 200 μm. (F) L'efficienza di trasfezione dei protoplasti di entrambi i genotipi di cavolo, utilizzando un reporter GFP espresso costitutivamente, è risultata superiore al 40%. Barra della scala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig02largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig03.jpg"> 
Figura 3: Risposta all'ipossia dei protoplasti di cavolo in condizioni di carenza di ossigeno. (A) I costrutti genici di risposta all'ipossia, promotori BoADH1 e BoSUS1L , sono utilizzati come reporter per valutare la risposta all'ipossia nei protoplasti di cavolo 'Fuyudori'. (B) Un totale di 5 μg di plasmidi reporter vengono trasfettati in protoplasti di cavolo 'Fuyudori', che vengono incubati in una soluzione W5 con bolle di ossigeno prima dell'esposizione a trattamenti di ipossia per 4 ore. I livelli di ossigeno vengono ridotti durante l'incubazione aggiungendo EC-ossirasi (0,6 unità·mL-1), OxyFluor (0,6 unità·mL-1) e solfito di sodio (1 g·mL-1) alla soluzione W5. Il trattamento con l'assorbente di ossigeno viene eseguito inserendo due sacche di assorbimento di ossigeno in un barattolo anaerobico da 3,5 L. Il gruppo "CK" rappresenta il gruppo di controllo senza alcun trattamento di ipossia. Dopo il trattamento, i protoplasti vengono raccolti per un doppio saggio della luciferasi. Ogni valore rappresenta la media ± SD, con n = 4. Lettere diverse indicano differenze significative (P &lt; 0,05) basate su un'ANOVA unidirezionale con test post-hoc LSD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Preparazione della soluzione enzimatica, della soluzione W5 e della soluzione MMG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
File supplementare 1: Dettagli plasmidici per la trasfezione di protoplasti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/Plasmids.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Sviluppo di un sistema di protoplasti di cavolo per lo studio della tolleranza all'ipossia nelle brassicacee

As climate change brings more heavy rainfall, cabbage, a key Brassicaceae vegetable, faces significant yield losses due to flooding-induced hypoxia ...

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