Sviluppo di un sistema di protoplasti di cavolo per lo studio della tolleranza all'ipossia nelle brassicacee
September 20th, 2024
Questo protocollo descrive un efficiente sistema di protoplasti di mesofillo di cavolo. Sono stati testati vari trattamenti carenti di ossigeno e il sistema ha mostrato un'elevata attivazione dei geni responsivi all'ipossia, facilitando gli studi sui meccanismi genetici e molecolari della tolleranza all'allagamento nelle verdure delle Brassicaceae .
Stiamo studiando come i cavoli reagiscono al basso livello di ossigeno a livello molecolare. Poiché i cavoli sono difficili da ottenere, stiamo sviluppando un sistema che utilizza cellule di cavolo isolate. Esponendo queste cellule di riserva, note anche come protoplasti, a condizioni di basso contenuto di ossigeno, possiamo studiare facilmente la loro risposta allo stress.
Lavorare con protoplasti sospesi in soluzione per studiare le risposte a basso contenuto di ossigeno è complicato. La grande sfida è mantenere una quantità sufficiente di ossigeno per i nostri campioni di controllo. Abbiamo trovato un modo per pompare l'ossigeno nel liquido.
Abbiamo convalidato il metodo attraverso saggi reporter di marcatori di ipossia. Abbiamo esaminato diversi metodi per gestire un basso contenuto di ossigeno e abbiamo scoperto che il pacchetto assorbitore di ossigeno funziona meglio. È facile da usare ed efficace, il che lo rende ideale per studiare come si comportano i protoplasti in condizioni di basso contenuto di ossigeno.
Lo studio del meccanismo molecolare nelle colture a foglia in condizioni di ipossia è stato impegnativo a causa della limitazione degli strumenti disponibili, ma con i recenti progressi abbiamo fatto grandi progressi utilizzando un sistema di protoplasti di cavolo con trattamento dell'ipossia. Questo nuovo metodo ci sta aiutando a capire quanto il basso impatto di ossigeno su queste piante a livello molecolare. In futuro, prevediamo di combinare il sistema protoplasto con l'immunoprecipitazione e i saggi reporter per illustrare il percorso di regolazione molecolare coinvolto nel cavolo durante lo stress da inondazione.
Il nostro obiettivo è identificare i principali regolatori della tolleranza alle inondazioni, che speriamo di aiutare nell'allevamento di una nuova cultivar di cavolo con una migliore tolleranza alle inondazioni. Per iniziare, riempi i fori rotondi di forma quadrata di un vassoio a 48 pozzetti con substrato per piante commerciali e semina Fuyudori e 228 semi di cavolo a circa un centimetro di profondità nel terreno di coltura. Per preparare 12,5 millilitri di soluzione enzimatica, preriscaldare una soluzione contenente 10 millimolari di MES e 0,6 molari di mannitolo a 55 gradi Celsius.
Quindi aggiungere l'1,5% di cellulasi R-10 e lo 0,75% di macerozima R-10. Mescola la soluzione e continua a scaldare a 55 gradi Celsius per 10 minuti. Lasciare raffreddare la soluzione enzimatica a temperatura ambiente.
Quindi aggiungere 10 millimolari di cloruro di calcio e lo 0,1% di albumina sierica bovina. Utilizzando un filtro per siringa da 0,22 micrometri, sterilizzare la soluzione enzimatica in una piastra di Petri di nove centimetri. Dopo due o tre settimane di crescita, raccogli le piantine di cavolo al secondo stadio fogliare per l'isolamento dei protoplasti mesofilli.
Raccogli le seconde foglie vere appena espanse da cinque a otto piantine di cavolo. Usando una lama di rasoio affilata, taglia le foglie in strisce da 0,5 a 1,0 millimetri. Trasferire immediatamente le strisce fogliari nella soluzione enzimatica appena preparata.
Sottoporre le strisce di foglie di cavolo a infiltrazioni sottovuoto al buio per 30 minuti. Dopo l'infiltrazione sotto vuoto, tenere le strisce fogliari immerse nella soluzione enzimatica al buio per quattro-16 ore. Il giorno successivo, diluire la soluzione contenente protoplasti con un volume uguale di soluzione W5 per fermare la digestione enzimatica.
Per rilasciare la sospensione dei protoplasti, agitare delicatamente la miscela su un agitatore orbitale. Quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare la soluzione di protoplasto a 150 G per due minuti a quattro gradi Celsius.
Aggiungere 10 millilitri di soluzione W5 lungo la parete del tubo a una velocità di flusso di circa un millilitro al secondo per lavare i protoplasti pellettati. Dopo l'ultima centrifugazione, risospendere i protoplasti nella soluzione W5 e porre la provetta sul ghiaccio per 30 minuti. Quindi rimuovere un millilitro di surnatante alla volta fino a rimuovere tutto il surnatante.
Risospendere i protoplasti in una soluzione di MMG pre-raffreddata con ghiaccio. Misurare la concentrazione di protoplasti utilizzando un emocitometro. Regolare la concentrazione finale a 4 volte 10 alla potenza di 5 protoplasti per millilitro utilizzando la soluzione MMG.
Dopo l'isolamento e la digestione notturna, la resa dei protoplasti è stata di 1,04 volte 10 alla potenza di 7 per Fuyudori e di 4,00 volte 10 alla potenza di 6 protoplasti per grammo di peso fresco per 228. L'efficienza di trasfezione del protoplasto è stata superiore al 40% sia nelle cultivar Fuyudori che in quelle 228, come dimostrato dal gene reporter GFP. Dopo aver isolato il protoplasto di cavolo, mescolare 100 microlitri di 4 volte 10 alla potenza di 4 protoplasti con 10 microlitri di plasmide e porre la miscela sul ghiaccio per 10 minuti.
Aggiungere un volume uguale di soluzione PEG appena preparata nella soluzione di protoplasto e mescolare delicatamente. Incubare la miscela di protoplasti a temperatura ambiente al buio per 10 minuti. Quindi aggiungere 440 microlitri di soluzione W5 per terminare la reazione.
Centrifugare i protoplasti trasfettati a 150 G per due minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere il pellet in 750 microlitri di soluzione W5 arricchita di ossigeno. Trasferire i protoplasti risospesi in una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti precodificata con albumina sierica bovina all'1%.
Per l'ipossia indotta da sacca che consuma ossigeno, posizionare una piastra contenente la soluzione di protoplasto W5 in un barattolo anaerobico da 3,5 litri. Quindi aggiungi due pacchetti di assorbitori di ossigeno nel barattolo per creare un ambiente ipossico. Dopo il trattamento, centrifugare i protoplasti a 150 G per due minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare il surnatante e congelare i protoplasti raccolti in azoto liquido prima di procedere al doppio saggio della luciferasi. Il pacchetto di assorbimento dell'ossigeno ha indotto un aumento di 7,0 volte dell'attività del promotore BoADH1 rispetto al controllo, dimostrando la più alta risposta ipossica. L'attività del promotore BoSUS1L è aumentata di oltre 5,6 volte, con il trattamento con pacchetto di assorbitori di ossigeno che ha mostrato la maggiore induzione tra i trattamenti.
Panoramica
Questo studio indaga le risposte molecolari dei protoplasti di cavolo a condizioni di basso contenuto di ossigeno, che simulano lo stress da allagamento. Sviluppando un nuovo sistema di protoplasti che migliora lo studio dei geni risponsivi all'ipossia, la ricerca mira a chiarire i meccanismi genetici alla base della tolleranza all'allagamento nei vegetali Brassicaceae.
Componenti chiave dello studio
Area di ricerca
- Risposte allo stress delle piante
- Tolleranza all'allagamento nei vegetali
- Meccanismi genetici e molecolari
Contesto
- I cavoli sono difficili da procurarsi, rendendo necessario un sistema cellulare come i protoplasti.
- La ricerca sulle risposte all'ipossia delle piante è limitata dalle tecniche disponibili.
- Comprendere i meccanismi molecolari può migliorare gli sforzi di selezione per una migliore tolleranza all'allagamento.
Metodi utilizzati
- Sviluppo di un sistema di protoplasti di cavolo isolato utilizzando la digestione enzimatica.
- Esposizione dei protoplasti a condizioni controllate di basso contenuto di ossigeno per imitare l'ipossia.
- Utilizzo di test reporter per validare l'attivazione dei geni risponsivi all'ipossia.
Principali risultati
- Estabilimento di un sistema di protoplasti di successo con alta efficienza di trasfezione.
- I protoplasti esposti a trattamenti di assorbimento di ossigeno hanno mostrato significativi aumenti nell'espressione dei geni risponsivi all'ipossia.
- Induzione di marcatori chiave dell'ipossia validata da test duali di luciferasi.
Conclusioni
- Lo studio evidenzia un metodo efficace per analizzare le risposte molecolari dei cavoli a basso ossigeno.
- I risultati potrebbero facilitare lo sviluppo di cultivar di cavolo con una maggiore tolleranza allo stress da allagamento.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Flooding-induced hypoxia is a major threat to Brassica crop yields, demanding robust early-stage tools for dissecting stress tolerance mechanisms. The cabbage protoplast system with controlled hypoxia induction enables rapid, quantitative interrogation of gene function in a transformation-recalcitrant species. This platform advances predictive confidence in target validation and accelerates the identification of molecular regulators for breeding resilient cultivars.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of hypoxia-responsive genes in a physiologically relevant plant system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating and quantifying promoter activation under defined oxygen conditions.
- Facilitates rapid hypothesis testing for candidate gene roles in stress adaptation pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, high-yield protoplast isolation and transfection workflow for downstream assays.
- Delivers reproducible, quantitative dual-luciferase readouts for promoter activity under hypoxia.
- Enables scalable screening of genetic constructs or chemical modulators affecting hypoxia response.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular findings with physiological stress responses relevant to crop improvement.
- Supports continuity from gene discovery to trait validation in breeding pipelines.
- Reduces translational risk by modeling stress adaptation in a commercially important species.
Pipeline & Workflow Integration
This protoplast-based system bridges early discovery and pre-breeding, enabling functional genomics, target validation, and quantitative screening in a single workflow.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for gene function in hypoxia tolerance pathways.
- Screening: Provides validated, reproducible quantitative assays for promoter activation.
- Analytics: Enables statistical comparison of gene activation across treatments and controls.
- Translational Research: Connects molecular responses to phenotypic outcomes relevant for cultivar development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse gene function and stress response studies in Brassica.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target gene selection for stress tolerance.
- Operational Value: Standardizes protoplast isolation and hypoxia induction for reproducible results.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for candidate genes in breeding pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets for crop resilience.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant cell isolation, transfection, and reporter assays.
- Needs access to controlled hypoxia induction equipment and dual-luciferase analytics.
- Demands cross-team standardization of protoplast preparation and assay conditions.
- Adaptation to other Brassica species may require protocol optimization.
- Potential limitations include protoplast viability and scalability for high-throughput studies.
