Name: Test di efficienza traslazionale utilizzando profili polisomici sotto stress termico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Scopri il profilo polisomico per analizzare l'efficienza traslazionale in Arabidopsis thaliana sotto stress termico. Questo metodo standardizzato consente di isolare RNA associati ai ribosomi e studiare la risposta allo stress nelle piante.

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<meta charset="utf8"></head><body>Analisi della regolazione traslazionale nell'Arabidopsis stressata da calore

<ol><li>Picard, F., Loubière, P., Girbal, L., Cocaign-Bousquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+translation+regulation+in+the+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">The significance of translation regulation in the stress response.</a> BMC genomics. 14, 1-11 (2013).</li>
<li>Yuan, S., Zhou, G., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+machinery%3A+the+basis+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genom%22%5BJournal%5D)">Translation machinery: the basis of translational control.</a> J Genet Genom. 51 (4), 367-378 (2024).</li>
<li>Dever, T. E., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elongation%2C+termination%2C+and+recycling+phases+of+translation+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (7), a013706(2012).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Dennis, M. D., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phosphorylation+of+plant+translation+initiation+factors+by+Arabidopsis+thaliana+CK2+holoenzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential phosphorylation of plant translation initiation factors by Arabidopsis thaliana CK2 holoenzymes.</a> J Biol Chem. 284 (31), 20602-20614 (2009).</li>
<li>Dennis, M. D., Person, M. D., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+plant+translation+initiation+factors+by+CK2+enhances+the+in+vitro+interaction+of+multifactor+complex+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of plant translation initiation factors by CK2 enhances the in vitro interaction of multifactor complex components.</a> J Biol Chem. 284 (31), 20615-20628 (2009).</li>
<li>Chen, G. H., Liu, M. J., Xiong, Y., Sheen, J., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOR+and+RPS6+transmit+light+signals+to+enhance+protein+translation+in+deetiolating+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">TOR and RPS6 transmit light signals to enhance protein translation in deetiolating Arabidopsis seedlings.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (50), 12823-12828 (2018).</li>
<li>Chang, H. H., Huang, L. C., Browning, K. S., Huq, E., Cheng, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphorylation+of+carboxyl-terminal+eIF2%CE%B1+by+SPA+kinases+contributes+to+enhanced+translation+efficiency+during+photomorphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">The phosphorylation of carboxyl-terminal eIF2α by SPA kinases contributes to enhanced translation efficiency during photomorphogenesis.</a> Nat Comm. 15 (1), 3467(2024).</li>
<li>Liu, M. J., Wu, S. H., Chen, H. M., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+translational+control+contributes+to+the+regulation+of+Arabidopsis+photomorphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Sys+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread translational control contributes to the regulation of Arabidopsis photomorphogenesis.</a> Mol Sys Biol. 8 (1), 566(2012).</li>
<li>Des Marais, D. L., Juenger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropy%2C+plasticity%2C+and+the+evolution+of+plant+abiotic+stress+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Pleiotropy, plasticity, and the evolution of plant abiotic stress tolerance.</a> Ann New York Acad Sci. 1206 (1), 56-79 (2010).</li>
<li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (10), 663-679 (2022).</li>
<li>Shulaev, V., Cortes, D., Miller, G., Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+for+plant+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Physio+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Metabolomics for plant stress response.</a> Physio Plantarum. 132 (2), 199-208 (2008).</li>
<li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+heat+stress+and+drought+stress+in+pearl+millet+based+on+Pacbio+full-length+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of heat stress and drought stress in pearl millet based on Pacbio full-length transcriptome sequencing.</a> BMC Plant Biology. 20, 1-15 (2020).</li>
<li>Wasternack, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+jasmonates+in+plant+stress+responses+and+development-applied+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Action of jasmonates in plant stress responses and development-applied aspects.</a> Biotechnol Adv. 32, 31-39 (2014).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+translational+induction+during+NLR-mediated+immunity+in+plants+is+dynamically+regulated+by+CDC123%2C+an+ATP-sensitive+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Global translational induction during NLR-mediated immunity in plants is dynamically regulated by CDC123, an ATP-sensitive protein.</a> Cell Host Microbe. 31 (3), 334-342 (2023).</li>
<li>Cho, H. Y., Chou, M. Y., Ho, H. Y., Chen, W. C., Shih, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+modulates+translation+dynamics+in+Arabidopsis+under+submergence+via+GCN2+and+EIN2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2.</a> Sci Adv. 8 (22), eabm7863(2022).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+TaHSFA6e+modulates+heat+shock+protein-mediated+translational+regulation+in+response+to+heat+stress+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat.</a> New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).</li>
<li>Maruri-López, I., Figueroa, N. E., Hernández-Sánchez, I. E., Chodasiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stress+granules%3A+trends+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Plant stress granules: trends and beyond.</a> Front Plant Sci. 12, 722643(2021).</li>
<li>Hamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+formation+is+induced+by+a+threshold+temperature+rather+than+a+temperature+difference+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress granule formation is induced by a threshold temperature rather than a temperature difference in Arabidopsis.</a> J Cell Sci. 131 (16), jcs216051(2018).</li>
<li>Jang, G. J., Jang, J. C., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+functions+of+stress+granules+and+processing+bodies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Dynamics and functions of stress granules and processing bodies in plants.</a> Plants. 9 (9), 1122(2020).</li>
<li>Ostberg, S., Schewe, J., Childers, K., Frieler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+crop+yields+and+their+variability+at+different+levels+of+global+warming%5BTitle%5D)+AND+%22Earth+Sys+Dyn%22%5BJournal%5D)">Changes in crop yields and their variability at different levels of global warming.</a> Earth Sys Dyn. 9 (2), 479-496 (2018).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+TaHSFA6e+modulates+heat+shock+protein-mediated+translational+regulation+in+response+to+heat+stress+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat.</a> New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).</li>
<li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (87), e51164(2014).</li>
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<li>Cheng, M. C., Liao, P. M., Kuo, W. W., Lin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+ETHYLENE+RESPONSE+FACTOR1+regulates+abiotic+stress-responsive+gene+expression+by+binding+to+different+cis-acting+elements+in+response+to+different+stress+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis ETHYLENE RESPONSE FACTOR1 regulates abiotic stress-responsive gene expression by binding to different cis-acting elements in response to different stress signals.</a> Plant Physiol. 162 (3), 1566-1582 (2013).</li>
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<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((detection+and+identification+of+newly+synthesized+proteomes+with+bioorthogonal+non-canonical+amino-acid+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">detection and identification of newly synthesized proteomes with bioorthogonal non-canonical amino-acid tagging.</a> Nat Protoc. 2 (3), 532-540 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+de+novo+protein+synthesis+in+starvation-induced+autophagy+using+bioorthogonal+noncanonical+amino+acid+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Acad+Press%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of de novo protein synthesis in starvation-induced autophagy using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging.</a> Acad Press. 588, 41-59 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Provetta eppendorf da 1,5 mL</td><td>Labcon</td><td>3012-870-000-9</td><td>Estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 13,2 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>ultracentrifugazione</td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Honeywell</td><td>32712</td><td>Profilo polisomiale</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Honeywell</td><td>32211</td><td>Estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Cicloesimide (CHX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-C7698</td><td>Profilo polisomico</td></tr>: <tr><td>Dietilpirocarbonato (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>Estrazione dell'RNA</td></tr>, <tr><td>Etanolo</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>32221</td>, <td>Estrazione dell'RNA</td></tr>, <tr><td>GeneChip, Kit di controllo dell'RNA poli-A eucariotico</td>, <td>Invitrogen</td><td>900433</td><td>Normalizzazione,</td></tr><tr><td>Glicerolo</td>, <td>Honeywell</td><td>15523</td>, <td>Normalizzazione,</td></tr><tr><td>Eparina</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>SI-H3149</td><td>Profilo polisomiale</td></tr><tr><td>HiScript III RT SuperMix per kit qPCR</td><td>Vazyme</td><td>R323-01</td><td>Normalizzazione</td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T.Baker</td><td>&nbsp; 3040-01</td><td>Profilo polisomatico</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-M8266</td><td>Profilo polisomico</td></tr><tr><td>MS terreno basale</td><td>Phyto</td><td>M524</td><td></td></tr><tr><td>Grafico dei picchi delle piante Pompa a siringa</td><td>Brandel</td><td>SYN4007LS</td><td>Profilo polisomico</td></tr><tr><td>Poliossietilene-10-Tridecil-Etere (PTE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2393</td><td>Profilo</td></tr> <tr><td>polisomaticoRNasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td>Profilo polisomiale</td></tr><tr><td>Sodio desossicolato (DOC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-D6750</td><td>Profilo polisomico</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td>Profilo polisomatico</td></tr><tr><td>SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>BP170-8882</td><td>Normalizzazione</td></tr><tr><td>TRI reagente</td><td>MRC</td><td>TR118</td><td>Estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>J.T.Baker</td><td>&nbsp; 4109-06</td><td>Profilo polisomiale</td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100K</td><td>ultracentrifugazione</td></tr><tr><td>UV/VISDETECTOR</td><td>Brandel</td><td>UA-6</td><td>Profilo polisoma</td></tr></tbody></table>

test di efficienza traslazionale utilizzando profili polisomici sotto stress termico

Translation Efficiency Test Using Polysome Profiles Under Heat Stress

Il tipo selvatico di Arabidopsis, Col-0, è stato coltivato su terreno MS in un fotoperiodo leggero di 16 h:8 h. Per il controllo, sono state utilizzate piantine di 5 giorni senza trattamento da stress termico. Il gruppo di stress termico è stato sottoposto a 1 ora di trattamento termico a 40 °C in un bagno d'acqua preriscaldato, mentre il gruppo di recupero è stato posto a 22 °C per 2 ore subito dopo il trattamento termico. Utilizzando diverse condizioni di trattamento termico e condizioni di recupero, possiamo utilizzare i passaggi successivi per misurare la loro efficienza traslazionale.
Prima dell'estrazione dell'RNA, il gradiente di saccarosio deve essere preparato per primo. Per separare l'RNA non polisomiale e polisomiale in base alla loro differenza di densità, abbiamo preparato una soluzione a gradiente con concentrazioni di saccarosio del 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% e 60%. Abbiamo quindi caricato le soluzioni del gradiente da alta a bassa concentrazione, partendo dal basso (Figura 1A). Successivamente, possiamo utilizzare questo gradiente per separare l'RNA non polisomiale a bassa densità nello strato superiore, mentre l'RNA polisomiale a densità più elevata sarà distribuito nello strato inferiore con concentrazioni di saccarosio più elevate. L'RNA non polisomiale e polisomiale è stato estratto dal Col-0 trattato o non trattato. Per evitare che le particelle nella soluzione influenzino i risultati dell'analisi del profilo dei polisomi, la soluzione contenente RNA deve essere filtrata attraverso un filtro cellulare per ottenere una soluzione di estrazione priva di particelle. Il surnatante filtrato è stato caricato su un gradiente di saccarosio pre-preparato ed equilibrato. Dopo l'ultracentrifugazione di campioni caricati con gradiente di saccarosio, l'RNA non polisomiale e polisomiale sono stati distribuiti in base alla densità all'interno del gradiente di saccarosio. Successivamente, la profilazione dei polisomi è stata eseguita utilizzando un frazionatore a gradiente di densità (Figura 1B). Il frazionatore a gradiente di densità è controllato utilizzando un software inizialmente calibrato con acqua deionizzata. Dopo la calibrazione, i campioni vengono caricati sul frazionatore dopo l'ultracentrifugazione. Operando in modalità di controllo software, la pompa a siringa per microvolumi inietta nel gradiente una soluzione di saccarosio con concentrazioni superiori al gradiente di saccarosio, spingendo il campione. Ciò consente di iniziare la misurazione dalla parte superiore del gradiente di saccarosio, dove la densità è inferiore, e procedere verso il basso, dove la densità è maggiore. Successivamente, vengono attivate le impostazioni del software per avviare l'acquisizione dei dati, generando il grafico del profilo dei polisomi attraverso la misurazione OD254 (Figura 1B). Quando osserviamo una maggiore intensità del segnale nella frazione polisomiale, indica che il campione mostra una maggiore efficienza di traslazione.
I grafici del profilo dei polisomi per piantine Col-0 di 5 giorni sottoposti a diversi trattamenti sono mostrati nella Figura 2. I risultati del gruppo di controllo dimostrano una netta separazione tra la frazione non polisomiale e la frazione polisomiale (Figura 2A). Tuttavia, dopo 1 ora di stress termico a 40 °C, l'intensità del segnale della frazione polisomiale è diminuita significativamente (Figura 2B). Quando le piantine trattate termicamente sono state lasciate recuperare a 22 °C per 2 ore, l'intensità del segnale della frazione polisomiale è tornata a un livello simile al gruppo di controllo (Figura 2C). I nostri risultati hanno dimostrato che il trattamento di stress termico di 1 ora ha ridotto significativamente l'efficienza di traslazione delle piantine di Arabidopsis. Tuttavia, le piante hanno richiesto 2 ore di recupero per ripristinare l'efficienza di traslazione a livelli paragonabili a quelli delle piantine che non soffrono di stress termico.
Per raccogliere ulteriori prove che confrontino l'efficienza di traduzione delle piantine Col-0 in diverse condizioni di trattamento, abbiamo isolato ed estratto le frazioni di RNA non polisomiale e polisomiale. La raccolta di frazioni di RNA non polisomiali e polisomiali è stata guidata dai risultati delle misurazioni del profilo dei polisomi. Per l'estrazione di RNA non polisomiale e polisomiale, utilizziamo il reagente fenolo/guanidinio tiocianato per estrarre i campioni di RNA isolati non polisomiali e polisomiali. Con il metodo di estrazione dell'RNA che abbiamo utilizzato, possiamo ottenere un RNA stabile e di alta qualità per le nostre analisi successive (Tabella 1). Successivamente, normalizzare l'RNA estratto con il kit di controllo dell'RNA Poly-A eucariotico GeneChip per mitigare gli errori causati dalle diverse perdite di estrazione. Successivamente, è stata utilizzata la PCR in tempo reale per quantificare l'espressione dei geni DAP , che sono inclusi nei geni di B. subtilis aggiunti al kit. L'analisi comparativa dei livelli di espressione genica DAP tra gruppi di RNA non polisomiali e polisomiali è stata condotta per stimare il contenuto di RNA in condizioni di perdita proporzionale (Figura 3A). Abbiamo calcolato il rapporto tra l'RNA polisomiale normalizzato e l'RNA totale per chiarire l'efficienza di traduzione tra di loro (Figura 3B). Infine, il rapporto di RNA nei polisomi è stato calcolato utilizzando il contenuto di RNA normalizzato (Figura 3C). I risultati del rapporto RNA nei polisomi sottoposti a diversi trattamenti di Col-0 hanno mostrato un pattern coerente con i risultati del profilo dei polisomi mostrati nella Figura 2A. Entrambi i risultati indicano che lo stress da calore riduce significativamente il rapporto RNA nella frazione polisomiale e questo effetto può essere invertito dopo un recupero di 2 ore a 22 °C (Tabella 1).
Da questo metodo, possiamo ottenere l'intera frazione di RNA non polisomiale o polisomiale con alta qualità piuttosto che separare l'RNA in frazioni aggiuntive23. I nostri risultati dimostrano anche che sia i profili dei polisomi che la percentuale di RNA nei polisomi possono riflettere efficacemente l'efficienza della traduzione in Arabidopsis con diverse condizioni trattate.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig01.jpg"> Figura 1: Diagramma del flusso di lavoro per la profilazione dei polisomi. (A) Illustrazione schematica della preparazione del gradiente di saccarosio in una provetta da centrifuga da 13 mL. (B) Il diagramma di flusso illustra il processo sperimentale di profilazione dei polisomi. In primo luogo, viene estratto il translatoma. Successivamente, l'RNA non polisomiale e polisomiale vengono separati in base alle loro differenze di densità utilizzando l'ultracentrifugazione in gradienti di saccarosio di densità variabili. OD254 viene misurato utilizzando un frazionatore a gradiente di densità per ottenere il grafico dei risultati del profilo dei polisomi sottostante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig02.jpg"> Figura 2: Profilazione polisomica di Col-0 in diverse condizioni. (A, B, C) I risultati del profilo dei polisomi di Col-0 in condizioni di (A) nessun trattamento termico (controllo), (B) trattamento termico a 40 °C per 1 ora e (C) recupero a 22 °C per 1 ora dopo il trattamento termico. L'RNA non polisomiale e polisomiale sono stati frazionati utilizzando un gradiente di saccarosio del 12,5%-60%. Le posizioni dell'RNA non polisomiale (NP) e polisomiale (PL) sono indicate sui profili. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig03.jpg"> Figura 3: Diagramma del flusso di lavoro dell'estrazione dell'RNA non polisomiale e polisomiale. (A) Un'illustrazione della normalizzazione dell'RNA mediante spike in. (B) Un'illustrazione della separazione dell'RNA non polisomiale e polisomiale e il calcolo della percentuale di RNA polisomiale. (C) La percentuale di RNA polisomiale in Col-0 trattato con diverse condizioni. Le barre di errore indicano la media ± SD (n=3 ripetizioni biologiche). *valore p &lt; 0,01, test t di Student. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>Contenuto (ng)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Controllo</td>
			<td>RNANP</td>
			<td>758.3</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.16</td>
		</tr><tr><td>RNAPL</td>
			<td>302.3</td>
			<td>2.21</td>
			<td>2.13</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Stress da calore</td>
			<td>RNANP</td>
			<td>821.5</td>
			<td>2.2</td>
			<td>2.15</td>
		</tr><tr><td>RNAPL</td>
			<td>174.3</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.21</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Guarigione</td>
			<td>RNANP</td>
			<td>797.2</td>
			<td>2.17</td>
			<td>2.16</td>
		</tr><tr><td>RNAPL</td>
			<td>300.9</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.18</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Contenuti e qualità dell'RNA non polisomiale e polisomiale. Questa tabella ha mostrato il contenuto e le qualità dell'RNA analizzati. Il contenuto di RNA è stato normalizzato dopo l'estrazione utilizzando metodi modificati.

Test di efficienza traslazionale utilizzando profili polisomici sotto stress termico

Translational control of different genes under heat stress is a critical step for plant adaptation to the environment. Assessing the translational ...

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Ribosomi svolgono un ruolo centrale nella sintesi proteica. Polyribosome (polisoma) frazionamento da saccarosio centrifugazione in gradiente di densità permette la determinazione diretta delle efficienze traduzione di mRNA individuali su una scala genome-wide. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per l'analisi biochimica dei ribosomi e fattori polisoma associati come accompagnatori e molecole di segnalazione.

Polisoma Frazionamento e analisi dei mammiferi Translatomes su scala Genome-wide

La capacità delle cellule di adattarsi allo stress è fondamentale per la loro sopravvivenza. La regolazione della traduzione dell'mRNA è una di queste strategie di adattamento, che prevede una rapida regolazione del proteoma. Qui, forniamo un protocollo standardizzato di profilazione dei polisomi per identificare mRNA specifici che vengono tradotti selettivamente in condizioni di stress.

Valutazione della Selective mRNA Traduzione in cellule di mammifero per polisoma Profiling

Questo protocollo descrive un metodo semplice per estrarre e frazionare i trascritti dai tessuti vegetali sulla base del numero di ribosomi legati. Permette una stima globale dell'attività traduttiva e la determinazione dello stato traduzionale di specifici mRNA.

Un metodo facile per piante polysome Profiling

L'obiettivo generale di tecnica di profilatura polisoma è analisi di attività traduzionale di singoli mRNA o del trascrittoma mRNA durante la sintesi proteica. Il metodo è importante per gli studi di regolamento di sintesi della proteina, l'attivazione di traduzione e repressione in salute e più malattie umane.

Polisoma Profiling nel testicolo di topo, cellule umane e di Leishmania

Qui presentiamo un protocollo per eseguire polisoma profilatura sul cuore isolato e perfuso del mouse. Descriviamo i metodi per aspersione di cuore, polisoma profiling e l'analisi delle frazioni polisoma rispetto al mRNA, Mirna e il proteoma polisoma.

Dinamica proteomica e miRNA analisi di polisomi da Mouse cuore dopo Langendorff aspersione isolata

Presentiamo una tecnica per stabilizzare rapidamente complessi traslazionali (biosintesi proteica) con reticolazione di formaldeide in cellule di lievito vivo e di mammifero. L'approccio consente di sezionare intermedi transitori e interazioni dinamiche RNA:proteina. I complessi reticolati possono essere utilizzati in molteplici applicazioni a valle come nei metodi di profilazione basati sul sequenziamento profondo, nella microscopia e nella spettrometria di massa.

Rapida fissazione in vivo e isolamento dei complessi traslazionali dalle cellule eucariotiche

Questo protocollo descrive come generare un profilo polisomico senza utilizzare generatori di gradienti automatizzati o sistemi di frazionamento del gradiente.

Profilazione dei polisomi senza generatori di gradienti o sistemi di frazionamento

Trasformazione del DNA plasmidi in E. coli con il metodo Heat Shock

In questo video si descrive un metodo per valutare la reazione psicofisiologica allo stress della persona utilizzando il biofeedback. Saremo anche presenti linee guida generali per la pianificazione del trattamento.

Lo stress di valutazione psicofisiologica Utilizzando Biofeedback

Scopri il profilo polisomico per analizzare l'efficienza traslazionale in Arabidopsis thaliana sotto stress termico. Questo metodo standardizzato consente di isolare RNA associati ai ribosomi e studiare la risposta allo stress nelle piante.

Test di efficienza traslazionale utilizzando profili polisomici sotto stress termico

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