Name: Co-coltura microfluidica dellepitelio renale sano e tumorale per modellare la progressione del cancro del rene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Scopri un modello microfluidico di cancro renale per studiare le interazioni tra cellule sane e tumorali. Questo sistema avanzato utilizza biostampa 3D e biosensori per simulare condizioni in vivo e analizzare i cambiamenti nell'espressione genica.

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NOTA: Questi protocolli delineano i passaggi completi per la preparazione di gel 3D di collagene-agarosio, l'iniezione di cellule, la perfusione dei campioni e l'estrazione per ulteriori analisi. Regolare i tempi e le condizioni di incubazione in base a specifici requisiti sperimentali.
1. Preparazione della matrice in gel di collagene e agarosio
<ol>
	<li>Stampa 3D NOTA: Per creare la forma appropriata per la matrice di gel, abbiamo sviluppato un design unico della camera che modella il gel in una forma organoide fisiologicamente rilevante (vedi File supplementare 1).<ol>
		<li>Progetta le camere utilizzando un software di progettazione assistita da computer. La camera comprende quattro compartimenti paralleli: due compartimenti cellulari, un compartimento della matrice e un canale di collegamento (Figura 1 e Figura 2).</li>
		<li>Costruisci le camere con la stampa 3D; Un ugello riscaldante fonde un filamento di bioplastica e lo deposita strato dopo strato. Per seguire questo protocollo, utilizzare il polipropilene (PP), un filamento bioplastico non tossico, e una stampante 3D di tipo cartesiano, che prende il nome dal sistema di coordinate XYZ.</li>
		<li>Aggiungi una funzione di forma a cono inverso ai compartimenti cellulari per dirigere le cellule nel canale.</li>
		<li>Dai una forma rotonda al compartimento della matrice, che è fondamentale per formare il gel di collagene.</li>
		<li>Collegare i compartimenti della cellula e della matrice con un canale (diametro 0,04 mm, Figura 3B), consentendo alle cellule di fluire dal compartimento cellulare al compartimento della matrice e di attaccarsi alla superficie del tubo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione di matrice di collagene per la coltivazione di cellule RPTEC-TERT1 NOTA: Questa procedura garantisce che la matrice di collagene sia preparata correttamente e caricata nella camera, creando un ambiente adatto per la successiva iniezione e coltivazione di cellule RPTEC/TERT1 e la crescita della struttura cellulare 3D. Assicurarsi che tutti i passaggi vengano eseguiti in condizioni sterili per evitare contaminazioni.<ol>
		<li>Preparare la soluzione reticolante mescolando 50 μL di genipina (30 mM) con 50 μL di NaOH (1 M) utilizzando un vortice per garantire una miscelazione accurata.</li>
		<li>Aggiungere 1.000 μl di collagene di tipo I alla soluzione preparata di genipina e NaOH mantenendo la miscela sul ghiaccio per evitare la gelificazione prematura. Mescolare nuovamente la soluzione utilizzando un vortice per ottenere una miscela omogenea. NOTA: Tenere continuamente la soluzione miscelata sul ghiaccio per evitare la gelificazione prematura.</li>
		<li>Utilizzando un puntale per pipetta da 1.000 μl, raccogliere l'intera soluzione preparata e aggiungere 150-200 μl di soluzione nello scomparto della matrice della camera stampata in 3D.</li>
		<li>Lasciare polimerizzare la matrice mantenendo la camera nell'incubatore di CO2 a 37 oC per 60-90 min. Aggiungere 150 μl di terreno di coltura sulla parte superiore della matrice e lasciarlo per una notte nell'incubatore.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione della matrice di collagene-agarosio e inclusione di cellule di Caki-1 NOTA: Entrambe le cellule RPTEC/TERT1 e Caki-1 sono state coltivate utilizzando lo stesso terreno di coltura, costituito da terreni DMEM F-12 ad alto glucosio integrati con ITS (10 μg/mL di insulina, 5,5 μg/mL di transferrina e 5 ng/mL di selenito di sodio), 10 ng/mL di fattore di crescita epidermico (EGF), 36 ng/mL di idrocortisone, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina (5% v/v) e 10% (v/v) di siero fetale di vitello (FCS).<ol>
		<li>Sciogliere la polvere di agarosio in acqua sterile o DPBS per ottenere una concentrazione finale del 2%. Porre la soluzione di agarosio su un blocco riscaldante impostato a 85 oC per garantire la completa dissoluzione. NOTA: Maneggiare con cura la soluzione di agarosio a causa della sua sensibilità alla temperatura.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inclusione di cellule Caki-1<ol>
		<li>Staccare le cellule Caki-1 dai loro palloni di coltura aggiungendo 1x tripsina-EDTA e incubarle a 37 °C fino a quando le cellule non si staccano. Neutralizzare la tripsina 1x aggiungendo un volume uguale di terreno di coltura.</li>
		<li>Raccogliere la sospensione cellulare, contare le cellule e centrifugare a 2.500 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere i pellet cellulari in terreno di coltura fresco fino a una concentrazione finale di 1 × 103 cellule/mL (Caki-1). NOTA: Assicurarsi che la sospensione cellulare sia accuratamente miscelata e priva di grumi prima di caricarla nella camera.</li>
		<li>Aggiungere 25 μl di sospensione cellulare in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. NOTA: Assicurarsi che la siringa o la pipetta sia sterilizzata e appropriata per la manipolazione delle cellule.</li>
		<li>Aggiungere 75 μl di collagene di tipo I nella provetta con la sospensione cellulare e il vortice. NOTA: Tenere la miscela continuamente sul ghiaccio per evitare una gelificazione prematura.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL di gel di agarosio fuso al 2% e mescolare accuratamente a vortice fino a quando il gel diventa omogeneo. NOTA: Garantire una distribuzione uniforme delle cellule all'interno del gel. Evitare l'introduzione di bolle d'aria durante l'iniezione, poiché possono interrompere la distribuzione cellulare e l'integrità del gel!</li>
		<li>Dopo 1 ora, aggiungere 150 μL di terreno cellulare nella parte superiore della matrice e rimuoverlo dalla camera utilizzando una spatola. Posizionare le matrici 3D con le cellule in una piastra a 24 pozzetti con 1.000 μL di terreno di coltura e incubare a 37 °C, 5% di CO2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67456/67456fig01.jpg"> 
Figura 1: Progettazione di una camera stampata in 3D per la ricostruzione dei tubuli renali. (A,B) Rappresentazione della camera stampata in 3D progettata per ospitare una matrice di collagene reticolato per ricostruire i tubuli renali. Ogni camera è composta da quattro scomparti individuali, che vengono utilizzati per produrre una quantità uguale di gel. 1-punto di inserimento per il filamento, 2-pre-camere da riempire solo con agar per evitare perdite, camera a 3 collageni, camera a 4 celle. (C) Dimensioni del gel di collagene reticolato e del tubulo renale incorporato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67456/67456fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67456/67456fig02v2.jpg"> 
Figura 2: Preparazione di gel di collagene e agar-collagene. (A) Camera stampata in 3D con filamenti inseriti. (B) La soluzione di collagene reticolato viene erogata nei pozzetti della camera (C) La camera riempita con soluzione di collagene viene posta nell'incubatore per facilitare la polimerizzazione della matrice (D) Raccolta delle cellule RPTEC-TERT1 prima dell'iniezione nella matrice di collagene (E) Aggiunta di sospensione cellulare al compartimento cellulare della camera (F) Rimozione del filamento con l'aiuto di una pinza, consentendo alle cellule di popolare la struttura tubolare cava all'interno della matrice (G) Sospensione di cellule RCC mescolate con collagene in una provetta da 1,5 ml (H) Aggiunta di una soluzione di agar al 2% delle cellule per generare il gel RCC. (I) I gel vengono inseriti nell'incubatore per facilitare la gelificazione della matrice (J,K,L) Rimozione del gel di collagene polimerizzato con i tubuli renali dalla camera stampata in 3D con l'aiuto di una spatola e posizionamento in una piastra a 24 pozzetti prima di un'ulteriore lavorazione (M,N,O) Rimozione del gel di collagene-agar polimerizzato con le cellule RCC con l'aiuto di una spatola, e il loro posizionamento in una piastra a 24 pozzetti prima di un'ulteriore elaborazione <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67456/67456fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67456/67456fig03.jpg"> 
Figura 3: Assemblaggio del sistema di coltura microfluidica. (A,B) Apertura dei compartimenti di coltura del chip Humimic2 utilizzando uno strumento dedicato (C) Dopo aver rimosso il terreno di coltura utilizzato per lavare il chip, aggiungere 400 μL di terreno di coltura fresco. (D,E) Dopo aver rimosso i gel renali e RCC dalle rispettive piastre a 24 pozzetti, posizionare ciascun gel nel compartimento di coltura di un singolo circuito di perfusione del chip Humimic utilizzando le spatole per maneggiare i gel. (F,G) Dopo aver posizionato i gel nel chip, le camere di coltura vengono sigillate e il chip viene collegato all'unità di perfusione attraverso tre micropompe in ciascun circuito microfluidico, collegate da tubi specializzati. (H) I chip vengono inseriti nell'incubatore per la durata del periodo di coltura (I) Parametri di perfusione impostati nell'unità di controllo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67456/67456fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
2. Iniezione di cellule RPTEC/TERT1
<ol>
	<li>Iniezione di cellule RPTEC/TERT1<ol>
		<li>Staccare le cellule RPTEC/TERT1 dai loro flaconi di coltura aggiungendo 1x tripsina-EDTA e incubando a 37 °C fino a quando le cellule non si staccano.</li>
		<li>Neutralizzare la tripsina 1x aggiungendo un volume uguale di terreno di coltura con integratori. Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare a 2.500 × g per 5 minuti.</li>
		<li>Scartare il surnatante e risospendere i pellet cellulari in un terreno di coltura fresco fino a una concentrazione finale di 1 × 106 cellule/mL (RPTEC/TERT1). Assicurarsi che la sospensione cellulare sia accuratamente miscelata e priva di grumi prima di caricarla nella camera.</li>
		<li>Caricare 10 μl della sospensione cellulare preparata in una micropipetta con puntale da 10 μl. Assicurarsi che la pipetta sia sterilizzata e appropriata per la manipolazione delle cellule. Iniettare con cautela la sospensione cellulare nel collagene solidificato (passaggio 1.2.4) attraverso il compartimento cellulare all'interno della camera.</li>
		<li>Rimuovere delicatamente il filamento usando una pinza, consentendo alle cellule di popolare la struttura tubolare cava all'interno della matrice NOTA: Garantire una distribuzione uniforme delle cellule all'interno del gel. Evitare l'introduzione di bolle d'aria durante l'iniezione, poiché possono interrompere la distribuzione cellulare e l'integrità del gel.</li>
		<li>Collocare le camere in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 . Dopo 60 minuti, aggiungere 150 μL di terreno cellulare sulla parte superiore della matrice per evitare che si secchi. Incubare per 24 ore per consentire alle cellule di acclimatarsi e integrarsi nella matrice gel.</li>
		<li>Il giorno successivo, rimuovere la matrice dalla camera utilizzando una spatola. Posizionare le matrici 3D con le cellule in una piastra a 24 pozzetti con 1.000 μl di terreno di coltura e incubare a 37 °C con CO2 al 5%. NOTA: I gel preparati con il tubulo renale ricostruito e gli sferoidi RCC incorporati saranno aggiunti al sistema di microfluidi per la co-coltura</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Perfusione di campioni cellulari 3D
<ol>
	<li>Perfusione cellulare 3D nel sistema di chip multiorgano<ol>
		<li>Collegare il chip con la cella 3D al sistema di perfusione con tubi.</li>
		<li>Impostare il sistema: Frequenza: 0,25 Hz, Vuoto: -220 mbar, Pressione: 800 mbar e collegare il chip 2 al sistema (Figura 3).</li>
		<li>Coltivare la coltura cellulare 3D dinamica per 5 giorni in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 3D campioni cellulari dopo la raccolta della perfusione
<ol>
	<li>Raccolta e analisi post perfusione<ol>
		<li>Rimuovere i gel dal sistema di perfusione e risciacquarli con PBS.</li>
		<li>Fissare i gel ponendo i campioni in paraformaldeide al 2% per 2-3 ore a temperatura ambiente. Conservare i campioni fissati a 4 ºC.</li>
		<li>Colorare i gel con coloranti (ad es. Hoechst33342, falloidina, ZO1, tubulina).</li>
		<li>Dopo 5 giorni di perfusione utilizzando il sistema di chip multiorgano, sono stati eseguiti vari saggi e metodi sulle colture cellulari 3D e sono stati raccolti terreni per valutare la vitalità cellulare, la morfologia, i livelli di espressione genica e gli aggiustamenti funzionali. Le cellule RPTEC/TERT1 nella matrice di gel di collagene e le cellule Caki-1 nella matrice di collagene-agarosio mantengono un'elevata vitalità; Confermarlo utilizzando saggi di vitalità come la colorazione viva/morta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Co-coltura di cancro renale e tessuto sano mediante sistemi microfisiologici

<ol><li>Ainslie, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+lung+models+to+evaluate+the+safety+of+new+pharmaceutical+modalities%3A+A+biopharmaceutical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microphysiological lung models to evaluate the safety of new pharmaceutical modalities: A biopharmaceutical perspective.</a> Lab Chip. 19 (19), 3152-3161 (2019).</li>
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<li>Ewart, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+assessment+and+economic+analysis+of+a+human+Liver-Chip+for+predictive+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Med%22%5BJournal%5D)">Performance assessment and economic analysis of a human Liver-Chip for predictive toxicology.</a> Commun Med. 2 (1), 154(2022).</li>
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<li>Chapron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+vascularized%2C+dual-channel+microphysiological+system+facilitates+modeling+of+proximal+tubular+solute+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Pharmacol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">An improved vascularized, dual-channel microphysiological system facilitates modeling of proximal tubular solute secretion.</a> ACS Pharmacol Transl Sci. 3 (3), 496-508 (2020).</li>
</ol>

Il protocollo descritto in questo studio rappresenta lo sviluppo di un modello complesso di cancro del rene, sfruttando l'integrazione di due tipi di cellule distinte - cellule epiteliali tubulari prossimali renali (RPTEC/TERT1) e cellule di carcinoma a cellule renali (Caki-1) - all'interno di specifiche matrici di gel di collagene e collagene-agarosio in un sistema microfluidico. La preparazione dei gel di collagene è fondamentale per il successo di questo modello. La precisa concentrazione di collagene e agarosio è nec...

<table><tbody><tr><td>1,5-2,0 mL&nbsp; provette&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>003012/10237-20205</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 24 pozzetti&nbsp;</td>Stampante 3D <td>Sarstedt</td><td>83.3922.500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Prusa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth</td><td>3810.3</td><td></td></tr><tr><td>AutoDesk Tinker software</td><td></td><td></td> CAD <td>software di progettazione assistita da computer</td></tr><tr><td>Caki-1 celle&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-46</td><td></td></tr><tr><td>Attività della caspasi</td><td>Promega</td><td>G8090</td><td>Saggio della caspasi 3/7</td></tr><tr><td>Vitalità cellulare</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>Saggio del titolo cellulare Glo</td></tr><tr><td>Collagene di tipo I - coda di ratto, 3,0 mg/mL</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/12F Medium&nbsp;</td><td>Soluzione PAN Biotech</td><td>PO4-41650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS&nbsp;</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-53500</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico</td><td>Merck</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3033</td><td></td></tr><tr><td>Genipina (30 mM)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>G4796</td><td></td></tr><tr><td>Chip HUMIMIC 2&nbsp;</td><td>TissUse</td><td></td><td>chip multiorgano</td></tr><tr><td>Unità di controllo UMIMICA&nbsp;</td><td>Unità di controllo a chip multiorgano</td> <td>TissUse</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone&nbsp;</td><td>Merck</td><td>H6909</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice (37 &deg; C, 5% CO2)&nbsp;</td><td>nd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulina, selenito di sodio, transferrina (IST)</td> <td>Merck</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>LDH rilascio</td><td>Promega</td><td>J2380</td><td></td></tr><tr><td>Spatola in metallo&nbsp;</td><td>nd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH (1 M)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>P031.2</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>Filamento di polipropilene (PP)&nbsp;</td><td>Verbatin</td><td>55952</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione facile da estrarre dall'RNA</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Cellule RPTEC/TERT&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL - 4031</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alfa ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY210-05</td><td></td></tr><tr><td>Triiodotironina (T3</td>) <td>Merck</td><td></td><td></td>709611</tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-021100</td><td></td></tr></tbody></table>

co-coltura microfluidica dell'epitelio renale sano e tumorale per modellare la progressione del cancro del rene

Microfluidic Co-culture of Renal Healthy and Tumor Epithelium to Model Kidney Cancer Progression

Il sistema HUMIMIC fornisce un ambiente dinamico che consente l'apporto continuo di nutrienti e ossigeno, rimuovendo al contempo le scorie metaboliche, mantenendo così la vitalità e la funzione cellulare per periodi prolungati. Questi sistemi sono particolarmente utili per la creazione di modelli complessi di organo su chip che replicano il microambiente di tessuti specifici. È progettato specificamente per applicazioni organ-on-a-chip e consente il controllo preciso del flusso del fluido e dello stress di taglio, fattor...

Co-coltura microfluidica dell'epitelio renale sano e tumorale per modellare la progressione del cancro del rene

Microphysiological systems (MPS) have enabled the introduction of more complex and relevant physiological elements into in vitro models, recreating ...

microfluidic-co-culture-renal-healthy-tumor-epithelium-to-model

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Ricerca sul cancro

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Questo protocollo fornisce un approccio conveniente per isolare e caratterizzare del mouse primario cellule tubolari renali che possono successivamente essere sub-coltivate per valutare funzioni biologiche renale ex vivo, tra cui bioenergetiche mitocondriali.

Isolamento, caratterizzazione e Throughput elevato flusso extracellulare analisi di cellule epiteliali tubolari renali primari del Mouse

Questo lavoro descrive due metodi per studiare lo sviluppo degli organi, una migliore impostazione dello xenotrapianto sulla membrana corioallantoica (CAM) dagli embrioni aviari che consente la vascolarizzazione di organi embrionali e organoidi coltivati e una nuova direzione z fissa metodo di coltura dell'organo con condizioni sperimentali modificate che consente l'imaging confocale time-lapse ad alta risoluzione.

Ottimizzazione della cultura organoide e organipica renale per la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e l'imaging di microscopia migliorato

Nell'era dell'immunoterapia e della profilazione genomica a singola cellula, la biologia del cancro richiede nuovi strumenti in vitro e computazionali per studiare l'interfaccia tumore-immunità in un contesto spaziotemporale appropriato. Descriviamo protocolli per sfruttare co-colture microfluidiche tumore-immunitarie in contesti 2D e 3D, compatibili con il monitoraggio dinamico e multiparametrico delle funzioni cellulari.

Modelli di co-coltura microfluidica per la dissezione della risposta immunitaria in microambienti tumorali in vitro

Le colture tubuloidi renali umane rappresentano un prezioso modello in vitro per studiare la fisiologia e la malattia renale. I tubuloidi possono essere stabiliti dal tessuto renale (sano e malato) e dall'urina, quest'ultima rappresenta una fonte facilmente ottenibile e meno invasiva di materiale di ricerca.

Generazione di tubuloidi renali umani da tessuti e urine

Presentato qui è un protocollo per progettare un sistema organo-on-a-chip personalizzato che ricapitola la struttura e la funzione della barriera di filtrazione glomerulare renale integrando cellule endoteliali epiteliali e vascolari geneticamente abbinate differenziate dalle cellule staminali pluripotenti indotte umane. Questo sistema bioingegnerizzato può far progredire la medicina di precisione renale e le applicazioni correlate.

Chip glomerulo renale isogenico ingegnerizzato da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Qui, descriviamo i protocolli per ottenere colture primarie di cellule epiteliali tubulari renali umane (HRTEC) dalla corteccia renale per sviluppare monostrati e colture tridimensionali su una matrice extracellulare (3D-HRTEC).

Sviluppo di colture primarie di cellule epiteliali tubulari renali umane in monostrati e condizioni tridimensionali

Presentiamo un protocollo ottimizzato per l'elaborazione di interi reni umani per isolare e coltivare cellule epiteliali del tubulo prossimale renale primario e l'applicazione di queste cellule in una piattaforma microfluidica tridimensionale, microfluidica e microfisiologica per ricapitolare il tubulo prossimale renale.

Isolamento di cellule epiteliali primarie del tubulo prossimale umano e loro utilizzo nella creazione di un modello microfisiologico del tubulo prossimale renale

Scopri un modello microfluidico di cancro renale per studiare le interazioni tra cellule sane e tumorali. Questo sistema avanzato utilizza biostampa 3D e biosensori per simulare condizioni in vivo e analizzare i cambiamenti nell'espressione genica.

Co-coltura microfluidica dell'epitelio renale sano e tumorale per modellare la progressione del cancro del rene

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