Knockout genico mediato da CRISPR-Cas9 basato sull'elettroporazione in cellule THP-1 e isolamento di cloni a singola cellula

La mia attività di ricerca si concentra sulla comprensione dei meccanismi che rendono i macrofagi resistenti all’infezione da HIV, il virus responsabile della pandemia di AIDS. In particolare, ci concentriamo sull’attività dell’enzima che viene chiamato HT-1 che degrada gli NTP, i mattoni dei genomi virali. Ma questo enzima ha anche altre attività che cerchiamo di chiarire.

Abbiamo stabilito un protocollo per l’ingegneria genetica delle cellule THP1. Queste cellule sono un surrogato ben consolidato per lo studio dei macrofagi umani. Ad esempio, la replicazione dell’HIV-1.

Queste cellule sono difficili da trasfettare per manipolare il loro contenuto proteico. Pertanto, stabiliamo metodi per manipolare il loro genoma utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Dalla progettazione di RNA SG fino alla validazione di popolazioni policlonali e monoclonali.

Il nostro protocollo mira a ottenere l’editing ad alta efficienza di un gene di interesse nelle cellule THP1 che saranno elettroporate con complessi ribonucleoproteici preassemblati costituiti dagli RNA energetici nucleasi Cas9. In questo approccio, l’attività di Cas9 è limitata nel tempo. Ciò riduce la possibilità di generare effetti target che spesso si verificano quando si utilizzano vettori lenti.

E in questo caso, infatti, l’espressione di Cas9 sta prolungando il tempo e quindi può essere dannosa per la cellula. Per iniziare, riempire ogni pozzetto di una piastra di coltura a 24 pozzetti con 500 microlitri di terreno RPMI 1640 senza antibiotici e integrato con FBS inattivato a caldo e filtrato al 20%. Mettere la piastra in un’incubatrice umidificata per una notte.

Per reidratare la singola guida secca o gli sgRNA a una concentrazione finale di 100 micromolari, aggiungere 10 microlitri di tampone TE per un nano mol di sgRNA. Agitare la soluzione per 30 secondi e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte per garantire una reidratazione completa. Il giorno successivo, per preparare la soluzione di sgRNA funzionante da 30 micromolari, omogeneizzare brevemente la soluzione di sgRNA da 100 micromolari con una pipetta, quindi diluire il gambo in acqua priva di nucleasi.

Agitare la soluzione per 30 secondi e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Diluire un microlitro di ciascuna delle tre soluzioni di lavoro di sgRNA da 30 micromolari e 0,5 microlitri di soluzione Cas9 da 20 micromolari in 3,5 microlitri di tampone di risospensione R, per assemblare le ribonucleoproteine Cas9 sgRNA aggiungere un rapporto molare da uno a nove. Agitare brevemente e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.

Per preparare un controllo non modificato, aggiungere 0,5 microlitri di soluzione Cas9 20 micromolari a 6,5 microlitri di tampone di risospensione R.Vortex brevemente e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente, aggiungere cinque microlitri di tampone di risospensione R ai campioni per ottenere un volume finale di 12 microlitri per condizione di elettroporazione. Per preparare le cellule THP-1 dopo il conteggio delle cellule, raccogliere un volume equivalente a 0,2 volte 10 alla potenza di sei cellule THP-1 e centrifugarle a 336G per cinque minuti a 20 gradi Celsius, aspirare il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere il pellet in 500 microlitri di PBS. Centrifugare nuovamente e risospendere il pellet cellulare nei 12 microlitri di soluzione ribonucleoproteica.

Per configurare il sistema di elettroporazione, posizionare la stazione di pipettaggio sotto una cabina di biosicurezza e posizionare una provetta di elettroporazione all’interno della cabina, aggiungere tre millilitri di tampone E dal kit di elettroporazione alla provetta di elettroporazione. Accendere il dispositivo di elettroporazione e utilizzare il touchscreen per impostare i parametri di elettroporazione, tensione a 1, 500 volt. Durata fino a 10 millisecondi.

E il numero a tre. Dotare la pipetta per elettroporazione di una punta e aspirare 10 microlitri della soluzione di ribonucleoproteina THP-1. Inserire la pipetta nel tubo di elettroporazione e premere start sullo schermo del dispositivo di elettroporazione.

Attendere che venga visualizzato il messaggio di completamento e rimuovere la pipetta dal tubo. Trasferire le cellule THP-1 in un pozzetto della piastra di coltura preriscaldata a 24 pozzetti e omogeneizzare delicatamente il campione. Riposizionare la piastra nell’incubatore umidificato e lasciare riposare le cellule indisturbate per 72 ore.

Dopo l’elettroporazione e il conteggio delle cellule, prelevare un volume equivalente a 0,1 volte 10 alla potenza di sei cellule THP-1 in una provetta da 1,5 millilitri. Centrifugare le celle a 336G per cinque minuti a 20 gradi Celsius e aspirare il surnatante prima di risospendere il pellet in 500 microlitri di PBS. Anche in questo caso, centrifugare le cellule, aspirare quanto più surnatante possibile senza disturbare il pellet e spezzare, congelare il pellet.

Per l’estrazione del DNA genomico risospendere il pellet con 50 microlitri di soluzione di estrazione del DNA. Omogeneizzarlo e trasferire l’intero volume in una provetta PCR da 0,2 millilitri. Agitare la provetta e centrifugarla brevemente per un impulso di tre secondi.

Posizionare il tubo in un termociclatore e riscaldare a 65 gradi Celsius per 15 minuti, seguito da 98 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, diluire il DNA estratto con 90 microlitri di acqua ultrapura, agitare e centrifugare brevemente a 5000G per tre secondi. Diluire il primer PCR in acqua ultrapura fino a una concentrazione finale di 10 micromoli.

Preparare la miscela per PCR in una provetta per PCR da 0,2 millilitri. Posizionare le provette PCR nel termociclatore ed eseguire il programma con le impostazioni specificate. Per popolazioni modificate policlonali in una nuova provetta da 0,2 millilitri.

Mescolare 17,5 microlitri di amplicio per PCR con due microlitri di tampone E due per un volume finale di 19,5 microlitri. Agitare brevemente la soluzione e centrifugare, alternativamente, per lo screening di cloni di singole cellule mescolare i prodotti della PCR dalle cellule di controllo modificate e non modificate in un rapporto uno a uno. Per la formazione etero duplex, posizionare i tubi in un termociclatore ed eseguire il programma dato.

Dopo la formazione etero duplex, aggiungere 0,5 microlitri di una soluzione di endonucleasi T sette alla provetta e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Per preparare i campioni per l’elettroforesi su gel, mescolare cinque microlitri di prodotti per la digestione dell’endonucleasi T7 o un prodotto per PCR non digerito con cinque microlitri di acqua e due microlitri di sei coloranti caricatori di xDNA, caricare i campioni e la scala dimensionale nel gel e far funzionare il gel a 80 volt per 45 minuti. L’editing genico mediato da CRISPR Cas9 del locus EGFP ha portato a un forte declino delle cellule GFP positive, raggiungendo una riduzione di oltre il 90% entro il settimo giorno dopo l’elettroporazione.

Entro il terzo giorno dopo l’elettroporazione, il numero di cellule si era dimezzato a causa dello stress indotto dall’elettroporazione, ma si era completamente ripreso entro il settimo giorno in mezzo RPMI completo. L’endonucleasi T7 e l’elettroforesi su gel di Agarosio hanno dimostrato la perdita di circa 75 frammenti di coppie di basi in cellule modificate, confermando l’editing CRISPR del sito bersaglio dell’EGFP.