Modello di biofilm aggregato per fibrosi cistica per studiare l'espressione genica rilevante per l'infezione

La nostra ricerca sviluppa un modello di biofilm aggregato nell'espettorato artificiale per replicare le infezioni polmonari nei pazienti con fibrosi cistica. Questo modello ci consente di analizzare i cambiamenti dell'espressione genica e capire perché i batteri diventano più resistenti alle terapie in queste condizioni rispetto agli ambienti standard di test farmacologici. Lo sviluppo di un modello di biofilm complesso ha evidenziato le sfide legate alla ricapitolazione dell'ambiente polmonare ostile, rendendo difficile prevedere se gli effetti antimicrobici in vitro si allineano con i risultati in vivo.

La natura specifica del paziente delle infezioni polmonari FC complica ulteriormente lo sviluppo di modelli di laboratorio efficaci per la sperimentazione degli antimicrobici. Nel corso di questa ricerca, abbiamo creato con successo un modello di biofilm aggregato polimicrobico, che fornisce una piattaforma per testare gli antimicrobici in un ambiente realistico, mostra il livello di resistenza che può essere osservato in questi biofilm ed evidenzia il potenziale delle terapie anti-virulenza mirate a componenti come l'alginato. Avere un modello di test antimicrobico progettato per imitare l'ambiente polmonare della FC colmerà il divario che esiste tra i test in vivo e quelli in vitro.

Inoltre, la valutazione del viroma dei batteri all'interno di un ambiente che imita più da vicino un polmone FC consentirà lo sviluppo e la sperimentazione di terapie anti-virulenza. Per iniziare, strisciare una singola perlina di pseudomonas aeruginosa PAO1 da colture di perline congelate su una coclea per brodo di lisogena. Incubare la piastra per 24 ore a 37 gradi Celsius.

Per la preparazione di biofilm di una singola specie, preparare colture notturne di pseudomonas aeruginosa PAO1 con una singola colonia dalla piastra di striatura e incubare durante la notte per 18 ore. Quindi, diluire la coltura a una densità ottica di 0,05 a 600 nanometri, equivalente a 1 volte 10 alla potenza di 8 unità formanti colonie per millilitro. Inoltre, diluire questa coltura da 1 a 100 in terreno SCFM2.

Quindi, aggiungere 180 microlitri di inoculo ai pozzetti di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti a fondo tondo. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius agitando a 75 giri al minuto per 24 ore. Ravviva pseudomonas aeruginosa PAO1 e staphylococcus aureus SH1000 da colture di perline congelate, come dimostrato in precedenza.

Ravvivare la candida albican CAF 2.1 come una singola striscia di perle su agar destrosio sabouraud e incubare le piastre per 24 ore a 37 gradi Celsius. Preparare colture notturne di stafilococco aureo e candida albicans con singole colonie dalle rispettive piastre di striatura in 5 millilitri di brodo di lisogena. Diluire le colture standardizzate per formare un unico inoculo contenente entrambe le specie alle concentrazioni richieste in SCFM2.

Quindi, aggiungere 162 microlitri di inoculo misto ai pozzetti di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius agitando a 75 giri al minuto per 24 ore per consentire la formazione di biofilm multispecie. Successivamente, aggiungere 14,2 microlitri della coltura notturna preparata di pseudomonas aeruginosa ai pozzetti della piastra per microtitolazione a 96 pozzetti e incubare nuovamente la piastra per consentire la formazione di biofilm polimicrobico.

Per iniziare, ottenere biofilm monospecie e multispecie in piastre per microtitolazione a 96 pozzetti. Per disgregare il biofilm, aggiungere 8,81 microlitri di stock di DNasi 1 direttamente ai pozzetti contenenti i biofilm, raggiungendo una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro. Incubare la piastra per un'ora a 37 gradi Celsius agitando a 75 giri al minuto.

Ottenere una soluzione madre antibiotica di meropenem a 2,56 milligrammi per millilitro. Eseguire diluizioni seriali di un fattore due per ottenere un intervallo di concentrazione compreso tra 0,01 milligrammi per millilitro e 2,56 milligrammi per millilitro. Ora, aggiungere 20 microlitri di ciascuna diluizione di miropenem ai biofilm, ottenendo un intervallo di dosaggio da 1 microgrammo per millilitro a 256 microgrammi per millilitro.

Sigillare la piastra per microtitolazione a 96 pozzetti con una pellicola trasparente e incubarla a 37 gradi Celsius per 24 ore, agitandola a 75 giri al minuto. I biofilm di pseudomonas di una singola specie non hanno mostrato una diminuzione significativa delle cellule vitali quando trattati con meropenem a qualsiasi dosaggio fino a 256 microgrammi per millilitro. Il recupero di Pseudomonas aeruginosa è stato di 0,74 log 10 unità formanti colonie per millilitro più alto in contesti di singole specie rispetto agli ambienti polimicrobici senza antibiotici.

Per iniziare, prepara i biofilm monospecie e multispecie per l'estrazione dell'RNA. Dopo l'incubazione, trasferire i biofilm da ciascun pozzetto in una provetta da microcentrifuga da un millilitro, raggruppando le repliche del biofilm per ogni campione. Centrifugare la provetta a 16.000 G per cinque minuti.

Se l'estrazione dell'RNA viene eseguita in un secondo momento, rimuovere il surnatante e conservare il pellet in 250 microlitri di soluzione di stabilizzazione dell'RNA a 80 gradi Celsius. Successivamente, scongelare la provetta con pellet a temperatura ambiente e centrifugare a 16.000 G per cinque minuti. Risospendere il pellet in 600 microlitri di reagente TRIzol e disinnescarlo manualmente utilizzando un ago da 0,2 millimetri collegato a una siringa da due millilitri, aspirando da 5 a 10 volte, o fino a quando il pellet non è completamente distrutto.

Seguire le linee guida del produttore per purificare l'RNA dai biofilm interrotti. Per quantificare l'RNA purificato, preparare la soluzione di lavoro con 199 microlitri di tampone e un microlitro di reagente per ogni campione. Mescolare 190 microlitri della soluzione di lavoro e 10 microlitri di standard uno e standard due in tubi separati.

Quindi, aggiungere 199 microlitri della soluzione di lavoro e 1 microlitro del campione di RNA nelle singole provette. Vorticare per 30 secondi e conservare in un luogo buio per cinque minuti. Quindi, sul fluorimetro, seleziona RNA, seguito da RNA ad ampio raggio e segui le istruzioni sullo schermo.

Dopo aver effettuato la lettura in bianco, pipettare un microlitro di RNA sul portacampioni dello spettrofotometro e misurare l'assorbanza a 260 per 280 nanometri. Per la sintesi complementare del DNA, preparare la miscela di reazione in provette. Posizionare i tubi in un termociclatore ed eseguire il programma.

Utilizzare immediatamente il CDNA o conservarlo a 80 gradi Celsius. L'espressione di algD nei biofilm di Pseudomonas aeruginosa di una singola specie non variava significativamente tra le concentrazioni di meropenem. Nei biofilm polimicrobici, l'espressione di algD era significativamente più alta a 256 microgrammi per millilitro, indicando un aumento della produzione di alginato in presenza di organismi co-colonizzanti.