Name: Visualizzazione della sialilazione intracellulare con la chimica a scatto e la microscopia ad espansione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Impara a visualizzare le glicoconiugati sialilati intracellulari con alta risoluzione spaziale utilizzando la chimica a scatto e la microscopia ad espansione. Questo metodo accessibile migliora l'imaging subcellulare senza attrezzature super-risoluzione costose.

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<meta charset="utf8"></head><body>Microscopia ad espansione per la visualizzazione di glicani sialilati intracellulari tramite MOE

<ol><li>De Souza, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+at+the+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Light microscopy at the limit.</a> Nat Cell Biol. 11 (Suppl 1), S22(2009).</li>
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<li>Gilormini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+bioorthogonal+dual+strategy%3A+ManNAl+and+SiaNAl+as+distinct+tools+to+unravel+sialic+acid+metabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways.</a> Chem Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).</li>
<li>Vanbeselaere, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkynyl+monosaccharide+analogues+as+a+tool+for+evaluating+Golgi+glycosylation+efficiency%3A+application+to+Congenital+Disorders+of+Glycosylation+%28CDG%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Alkynyl monosaccharide analogues as a tool for evaluating Golgi glycosylation efficiency: application to Congenital Disorders of Glycosylation (CDG).</a> Chem Commun. 49 (96), 11293-11295 (2013).</li>
<li>Gilormini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+glycomics+enrichment%3A+imaging+the+recycling+of+sialic+acid+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Chemical glycomics enrichment: imaging the recycling of sialic acid in living cells.</a> J Inherit Metab Dis. 4 (3), 515523(2018).</li>
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<li>Klimas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnify+is+a+universal+molecular+anchoring+strategy+for+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy.</a> Nat Biotechnol. 41 (6), 858869(2023).</li>
</ol>

L'attuale protocollo di marcatura del CuAAC non include l'aminoguanidina nel tampone di reazione. Poiché ha lo scopo di visualizzare i glicoconiugati intracellulari, viene eseguito su cellule che vengono fissate dopo la fase di incorporazione metabolica, per evitare qualsiasi problema di citotossicità e migliorare l'assorbimento del sistema catalitico. L'uso dell'aminoguanidina è tipicamente raccomandato per la marcatura della superficie cellulare delle cellule viventi per prevenire reazioni collaterali tra deidroascorba...

La microscopia a fluorescenza, sebbene ampiamente utilizzata per l'etichettatura e la visualizzazione di molecole specifiche all'interno delle cellule, è intrinsecamente limitata nella risoluzione dal limite di diffrazione di Abbe della luce1, che limita la capacità di distinguere tra oggetti più vicini di circa 200-250 nm. Questa limitazione deriva dalla natura ondulatoria della luce e dall'apertura numerica della lente dell'obiettivo del microscopio, introducendo una sfida nell'imaging delle strutture subcellulari. Il superamento di queste limitazioni fornisce una migliore comprensione di alcuni processi biologici su scala nanometrica.
Per superare il limite di diffrazione della luce, sono state sviluppate tecniche di microscopia a super-risoluzione come STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) e STED (Stimulated Emission Depletion) 2,3. STORM si basa sull'attivazione stocastica dei fluorofori, consentendo di visualizzare solo un sottoinsieme sparso in un dato momento. Ciò consente la localizzazione precisa dei singoli fluorofori, che consente la ricostruzione di un'immagine ad alta risoluzione. STED, d'altra parte, migliora la risoluzione utilizzando un laser di deplezione per estinguere selettivamente la fluorescenza attorno alla periferia del punto di eccitazione, restringendo efficacemente la funzione di diffusione del punto.
Questi approcci contrastano con la microscopia a campo largo o confocale, in cui tutti i fluorofori vengono rilevati simultaneamente, ottenendo un'immagine che combina tutti i modelli di diffrazione e impedisce la distinzione tra singoli fluorofori vicini, portando a una perdita di risoluzione. Tuttavia, questi metodi di super-risoluzione richiedono sorgenti luminose, apparecchiature, preparazione dei campioni e/o fluorofori molto specifici, rendendo queste tecnologie costose, di difficile accesso nella maggior parte dei laboratori e difficili da implementare negli esperimenti di routine. Questi vincoli hanno portato la comunità scientifica a cercare soluzioni alternative per ottenere una risoluzione più elevata, che fossero compatibili con le apparecchiature di microscopia prontamente disponibili e i protocolli di colorazione di routine. Nel 2015, Boyden e collaboratori hanno sviluppato un metodo per aggirare i limiti della microscopia ottica espandendo fisicamente il campione, chiamato Expansion Microscopy (ExM)4.
ExM è un metodo in tre fasi che fornisce dettagli su scala nanometrica di campioni biologici senza superare il limite di diffrazione della luce (Figura 1). Invece, utilizza microscopi convenzionali a diffrazione limitata per visualizzare campioni che sono stati fisicamente ingranditi in modo isotropo. La prima fase, chiamata gelificazione, consiste nell'incorporare il campione biologico, tipicamente cellule o tessuti fissati, in un idrogel polielettrolitico rigonfiabile a base di acrilato di sodio e acrilammide. Il campione biologico viene quindi sottoposto a un trattamento enzimatico per degradare parzialmente alcuni componenti come proteine o membrane e abbattere le strutture cellulari dense per garantire che le cellule possano espandersi in modo uniforme. Questa fase, chiamata digestione, aiuta a raggiungere questo obiettivo omogeneizzando i componenti strutturali del campione per quanto riguarda le proprietà meccaniche, prevenendo l'espansione differenziale che potrebbe portare alla distorsione del campione. Infine, nell'ultima fase, chiamata espansione, il campione incorporato e digerito in idrogel viene posto in acqua deionizzata, provocandone il rigonfiamento. Questa tecnologia fa sì che il campione si espanda di un fattore di ingrandimento lineare di circa 4-5x in ogni dimensione, consentendo la visualizzazione di dettagli cellulari fini utilizzando tecniche di microscopia standard. Data la natura isotropa dell'espansione, il campione biologico ingrandito all'interno della matrice di gel conserva i suoi dettagli geometrici tridimensionali e le relazioni spaziali tra i suoi vari componenti strutturali. Le informazioni spaziali vengono quindi preservate in caso di rigonfiamento, mentre la distanza tra le etichette fluorescenti ancorate al gel o le biomolecole aumenta uniformemente in tutte le direzioni. Ciò consente una migliore separazione dei segnali, con conseguente maggiore risoluzione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig01.jpg"> 
Figura 1: Panoramica del protocollo ExM. (a) Gelificazione: il campione biologico è ancorato e incorporato all'interno di un idrogel di polielettrolita rigonfiabile. (b) Digestione: le proprietà meccaniche del campione vengono omogeneizzate attraverso l'uso di enzimi e detergenti, scomponendo le proteine e le membrane lipidiche che altrimenti limiterebbero l'espansione e creerebbero distorsioni. (c) Espansione: l'idrogel viene immerso in acqua deionizzata, provocandone l'espansione isotropica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67479/67479fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Dal 2015, ExM ha visto significativi miglioramenti tecnologici nella conservazione delle informazioni spaziali. In particolare, sono stati progettati vari ancoranti molecolari per legare covalentemente le biomolecole direttamente all'idrogel rigonfiabile 5,6. In questo protocollo, abbiamo utilizzato la N-acrilossisuccinimide (NAS), che reagisce con i gruppi amminici liberi delle biomolecole (tipicamente, residui di lisina o posizioni N-terminali delle proteine) per bioconiugare un gruppo acriloil alle proteine della cellula, comprese le glicoproteine. Questo gruppo acriloil reagisce quindi con altri monomeri attraverso reazioni di reticolazione durante la gelificazione, ancorando queste biomolecole direttamente al polimero.
ExM è compatibile con un'ampia gamma di metodi di marcatura, tra cui l'ingegneria degli oligosaccaridi metabolici (MOE). Il MOE è un potente strumento che consente la marcatura dei glicani incorporando analoghi di precursori metabolici dotati di una maniglia chimica bioortogonale7. Questi analoghi, noti come reporter chimici, si integrano nelle vie metaboliche senza causare tossicità. Nell'approccio MOE, i monosaccaridi reporter vengono trasformati metabolicamente in zuccheri nucleotidici attivati e quindi trasferiti ai glicoconiugati nascenti. Il nostro obiettivo principale è lo studio della sialilazione, in particolare della dinamica intracellulare e del traffico di N-glicoproteine sialilate, che è cruciale nel contesto della salute e della malattia grazie al suo ruolo nelle interazioni cellula-cellula, nella regolazione immunitaria e nello sviluppo. La sialilazione anomala è implicata in malattie come il cancro 8,9,10,11, le malattie infettive 12 e le malattie genetiche 13,14,15, rendendola un obiettivo chiave per lo sviluppo terapeutico e la scoperta di biomarcatori. La comprensione della sialilazione migliora le conoscenze sulla glicobiologia e sui meccanismi delle malattie.
La sialilazione può essere sondata utilizzando MOE con analoghi dell'acido N-acetilneuraminico (Neu5Ac), l'acido sialico più abbondante nell'uomo, o con analoghi di N-acetilmannosamina (ManNAc), un precursore metabolico di Neu5Ac, con un manico bioortogonale 8,16. ManNAc viene convertito in Neu5Ac nel citosol, quindi attivato in acido citidina-5′-monofosfo-N-neuraminico (CMP-Neu5Ac) nel nucleo. Una volta attivate in uno zucchero nucleotidico, le siloil transferasi nell'apparato di Golgi trasferiscono le unità Neu5Ac alle posizioni terminali delle catene glicaniche in crescita (Figura 2). A seguito dell'incorporazione metabolica di derivati innaturali del ManNAc, i glicani sialilati marcati possono essere legati in modo covalente a un fluoroforo contenente un gruppo reattivo complementare alla maniglia reporter attraverso la chimica a clic bioortogonale. Ciò consente l'osservazione diretta dei glicoconiugati in vivo o ex vivo.
Per la maggior parte dei reporter di monosaccaridi, è necessaria una forma peracetilata per attraversare la membrana plasmatica attraverso la diffusione passiva. Tuttavia, sia i reporter peracetilati che quelli non protetti hanno dimostrato di sondare efficacemente la sialilazione16. I reporter di sialilazione non protetti sono in grado di entrare nelle cellule attraverso meccanismi di trasporto attivi, vale a dire la pinocitosi per gli analoghi di Neu5Ac e un trasportatore non ancora identificato per ManNAc. Mentre gli zuccheri non protetti richiedono una concentrazione più elevata (in genere 100-500 μM) per ottenere effetti comparabili, una volta all'interno della cellula, possono entrare direttamente nella via metabolica dell'acido sialico. Al contrario, gli zuccheri peracetilati devono essere completamente deacetilati da esterasi intracellulari non specifiche prima di diventare metabolicamente attivi. Sebbene possano essere utilizzati a concentrazioni più basse (tipicamente 10-50 μM), la deacetilazione incompleta può interferire con l'attività enzimatica o portare all'incorporazione di analoghi dell'acido sialico parzialmente acetilato, potenzialmente distorcendo l'analisi a valle. Inoltre, il rilascio di acido acetico può influenzare il pH localmente, influenzando potenzialmente la funzione cellulare. Chen e colleghi hanno anche dimostrato che gli zuccheri per-O-acetilati reagiscono con i residui di cisteina libera nelle proteine attraverso un meccanismo non enzimatico, portando all'incorporazione fuori bersaglio e all'aumento del segnale non specifico17,18. Nel presente protocollo, impieghiamo quindi reporter ManNAc non protetti.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig02.jpg"> 
Figura 2: Ingegneria degli oligosaccaridi metabolici e marcatura degli acidi sialici. UDP-GlcNAc è convertito in ManNAc dal dominio UDP-GlcNAc 2-epimerasi di GNE/MNK nel citosol. ManNAc viene quindi fosforilato nel citosol dal dominio ManNAc 6-chinasi di GNE/MNK per formare ManNAc-6-fosfato. La N-acetilneuraminato sintasi catalizza la condensazione di ManNAc-6-P con fosfoenolpiruvato per produrre Neu5Ac-9-fosfato, che viene successivamente defosforilato dalla fosfatasi dell'acido sialico per produrre Neu5Ac. Neu5Ac può anche essere fornito dalla via di salvataggio attraverso l'endocitosi e il riciclo lisosomiale8. Dopo il trasporto al nucleo, viene convertito in CMP-Neu5Ac dalla CMP-sialica acido sintetasi. Nell'apparato di Golgi, CMP-NeuAc è il substrato delle sialiltransferasi che introducono una porzione Neu5Ac nelle posizioni terminali dei glicani sui glicoconiugati in maturazione, che sono infine espressi a livello della membrana cellulare o secreti. I reporter chimici ManNAz dotati di un manico bioortogonale possono penetrare nella cellula attraverso un trasportatore attivo non identificato ed entrare nella via metabolica. Le unità Neu5Az marcate incorporate nei glicani dopo la biosintesi vengono quindi marcate attraverso la coniugazione mediata da CuAAC di una sonda fluorescente. Abbreviazioni: NAc = N-acetile; UDP-GlcNAc = Uridina difosfato N-acetilglucosamina; ManNAc = N-acetilmannosamina; GNE = UDP-GlcNAc 2-epimerasi; MNK = ManNAc 6-chinasi; ManNAc-6-P = ManNAc-6-fosfato; NANS = N-acetilneuraminato sintasi; PEP = fosfoenolpiruvato; Neu5Ac = acido N-acetilneuraminico; Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-fosfato; NANP = acido sialico fosfatasi; CMP = citidina-5′-monofosfato; CMAS = acido CMP-sialico sintetasi; STs = sialiltransferasi; ManNAz = N-azidoacetilmannosamina; Neu5Az = acido N-azidoacetilneuraminico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67479/67479fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tra le possibili reazioni bioortogonali, abbiamo focalizzato il nostro interesse sulla cicloaddizione azide-alchino catalizzata dal rame (CuAAC)16,19. Secondo la nostra esperienza, il CuAAC è l'opzione migliore per marcare i glicani intracellulari nelle cellule fissate. Questa reazione è ben consolidata, studiata a fondo in chimica bioortogonale ed è stata standardizzata per l'uso in ambienti biologici complessi, fornendo una solida base di conoscenze e protocolli ottimizzati. La sua cinetica veloce offre infatti un'elevata efficienza e specificità di reazione, e coinvolge gruppi azidici e alchini facili da sintetizzare, stabili, assenti dai sistemi viventi e inerti verso le biomolecole native, rendendolo ideale per applicazioni a celle fisse in cui la tossicità del rame non è un problema. La cicloaddizione alchino-azide promossa dal ceppo (SPAAC)20,21, pur evitando la tossicità del rame, ha una cinetica più lenta e sonde più voluminose, che tende a portare a un segnale di fondo più elevato e a una diminuzione del rapporto segnale/rumore per applicazioni intracellulari a causa dell'intrappolamento idrofobico, mentre la domanda di elettroni inversa Diels-Alder (IEDDA)22,23, sebbene veloce e priva di rame, comporta una sintesi di sonde più complessa e richiede gruppi reporter più ingombranti che devono ancora essere completamente caratterizzati nelle applicazioni MOE. Poiché ExM richiede esclusivamente celle fisse, CuAAC offre una soluzione robusta ed efficiente per la marcatura bioortogonale.
Questo articolo presenta un protocollo per la visualizzazione delle glicoproteine sialilate intracellulari nelle cellule, combinando la marcatura metabolica, la chimica del clic bioortogonale e la microscopia ad espansione. Nelle procedure sperimentali descritte in questo articolo, utilizziamo la N-azidoacetilmannosamina (ManNAz) come reporter chimico e la legatura CuAAC di piccoli fluorofori organici viene eseguita prima della procedura di espansione. Le glicoproteine sono ancorate all'idrogel con NAS prima della gelificazione, della digestione e dell'espansione. La marcatura MOE degli acidi sialici può essere associata ad approcci di immunofluorescenza per la valutazione della co-localizzazione, come esemplificato qui con un anticorpo primario di topo anti-GM130 localizzato nell'apparato cis-Golgi. Questo protocollo può essere applicato alle cellule nel loro stato fisiologico o alle cellule che sono state sottoposte a trattamento chimico. Per illustrare ciò, la clorochina è stata utilizzata per inibire la funzione lisosomiale, che influenza l'elaborazione e il traffico delle glicoproteine all'interno delle cellule. La colorazione nucleare viene utilizzata come punto di riferimento, non solo per localizzare le cellule, ma anche come indicatore della qualità del processo ExM. Il fattore di espansione può infatti essere misurato confrontando le dimensioni del nucleo pre-espansione (preExM) e post-espansione (postExM).

<table><tbody><tr><td>(+) Sodio L-ascorbato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>12 pozzetti piastra per coltura cellulare</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>Acido acrilico N-idrossisuccinimide estere&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8060</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 alchino&nbsp;</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-1277-5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 capra anti-topo</td><td>IgG Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>Amonium persulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9913</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrilammide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>BTTAA</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-067-100</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifugazione 2 mL</td><td></td><td>EPPENDORF 30120094</td><td></td></tr><tr><td>sale di clorochina difosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti 12 mm #1</td><td>epredia</td><td>CB00120RA120MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti 32 mm #1</td><td>epredia</td><td>CB00320RA140MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ad alto contenuto di glucosio</td><td>Dutscher</td><td>L0104-500</td><td></td></tr> Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS)&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>Fetale Siero Bovino</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast 533T</td> <td>-</td><td></td> <td>Raccolto da individuo sano</td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.9.0</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gelatina</td><td>Bio-RAD</td><td>170-6537</td><td></td></tr><tr><td>Guanidina HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>50950</td><td></td></tr><tr><td>Cellule HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 10.2</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Euromedex</td><td>PB0447-B</td><td>Microscopia confocale anidro</td></tr><tr><td>LSM 780&nbsp;</td><td>Zeiss-MCF7</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilmannosamina (ManNAc)</td><td>BIOSYNTH</td><td>MA05269</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carlo Erba</td><td>479687</td><td></td></tr><tr><td>N-azidoacetilmannosamina (ManNAz)</td><td>BIOSYNTH</td><td>MA46002</td><td></td></tr><tr><td>Objectif "Plan-Apochromat" 63x/1,4 Olio DIC M27</td><td>Zeiss</td><td>420782-9900-799&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 10x</td><td>Euromedex</td><td>ET330</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td>da&nbsp; Tritirachium album</td></tr><tr><td>topo purificato GM130 anticorpo</td><td>BD Bioscience</td><td>610822</td><td>50 &micro; g</td></tr><tr><td>Acrilato di sodio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408220</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flacone</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>tris Acetato EDTA (TAE) 10x</td><td>Euromedex</td><td>EU0202-B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Dutscher</td><td>702630</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 1x</td><td>Dutscher</td><td>L0930-100</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione della sialilazione intracellulare con la chimica a scatto e la microscopia ad espansione

Visualizing Intracellular Sialylation with Click Chemistry and Expansion Microscopy

Di seguito è mostrata l'applicazione del protocollo per visualizzare le glicoproteine sialilate nelle cellule HeLa (Figura 3A) e nelle cellule MCF7 (Figura 3B), omettendo il trattamento CQ (sezione 2 del protocollo) e la colorazione di co-localizzazione in immunofluorescenza (fase 5.3 del protocollo).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig03.jpg"> 
<stron...

Visualizzazione della sialilazione intracellulare con la chimica a scatto e la microscopia ad espansione

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visualizing-intracellular-sialylation-with-click-chemistry-expansion

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Ritenzione molecolare universale con microscopia ad espansione 11 volte

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Generazione di cellule dendritiche derivate da monociti con diversi fenotipi sialilati

Impara a visualizzare le glicoconiugati sialilati intracellulari con alta risoluzione spaziale utilizzando la chimica a scatto e la microscopia ad espansione. Questo metodo accessibile migliora l'imaging subcellulare senza attrezzature super-risoluzione costose.

Visualizzazione della sialilazione intracellulare con la chimica a scatto e la microscopia ad espansione

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