Name: Generazione di sferoidi da vari condrociti utilizzando condizioni di bassa adesività per gravità e mini-bioreattori fatti in casa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Scopri come generare sferoidi condrocitari da cellule iPSC in condizioni di bassa adesività utilizzando mini-bioreattori. Questo metodo scalabile migliora le strategie di riparazione della cartilagine nelle malattie articolari croniche.

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Lo studio è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico del LOPUKHIN FRCC PCM (protocollo n. 2019/02 del 9 aprile 2019). Tutti i campioni dei donatori sono stati ottenuti in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti e/o dai loro tutori legali.
NOTA: Mantenere la tecnica sterile per tutto il protocollo. Riscaldare tutti i terreni di coltura e le soluzioni a 37 °C prima di applicarli su cellule o sferoidi. Coltivare le cellule in un incubatore di CO2 a 37 °C, con il 5% di CO2 e l'80% di umidità. Lo schema del protocollo è illustrato nella Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67481/67481fig1.jpg"> 
Figura 1: Protocollo per la produzione di condrosfere dalla linea iPSC IPSRG4S. (A) Inizialmente, le iPSC vengono coltivate in terreni di cellule staminali pluripotenti fino a raggiungere l'80% di confluenza. (B) Per indurre la differenziazione verso la linea condrocitica, le iPSC vengono poi coltivate nel terreno A per 2 giorni. Il terreno viene successivamente sostituito con una formulazione priva di Chir 99021 e dell'inibitore della Rho chinasi e le cellule vengono coltivate per altri 6 giorni con cambi di terreno ogni 2 giorni. (C) Le cellule vengono quindi trasferite al terreno B per promuovere la condrogenesi per i successivi 10 giorni. (D) Una volta raggiunto un numero sufficiente di cellule, il processo avanza allo stadio di produzione degli sferoidi. (E) Le cellule sono aggregate in sferoidi in condizioni di bassa aderenza per gravità. (F) Gli sferoidi risultanti vengono coltivati in mini-bioreattori con mezzo B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67481/67481fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
1. Trasformazione di piastre di Petri in mini-bioreattori
NOTA: dettagli in un precedente articolo5.
<ol>
	<li>Tagliare le provette da centrifuga in anelli alti 7-8 mm utilizzando le forbici sterili per autoclave (impostazioni dell'autoclave: 121 °C (250 °F) a 15 psi, 30 min e asciugatura post-autoclave per 20 min).</li>
	<li>Frantumare le piastre di Petri a bassa adesione, non trattate o microbiologiche in piccoli pezzi. Sciogliere circa 1 g di particelle di plastica in 10 ml di cloroformio durante la notte per creare una soluzione di plastica liquida. Eseguire questa procedura in una cappa aspirante.</li>
	<li>Verificare che la plastica liquida sia sufficientemente viscosa per il pipettaggio. Assicurarsi che le goccioline mantengano una forma sferica piuttosto che diffondersi sulla superficie. Se la soluzione è troppo liquida, aggiungere altre particelle di plastica, richiedendo solitamente 1-3 g. Se è troppo denso, aggiungere altro cloroformio, che di solito richiede fino a 5 ml.</li>
	<li>Formare una manopola di plastica al centro di una piastra di Petri sterile a bassissima adesione da 60 mm utilizzando uno dei due metodi efficaci descritti di seguito.<ol>
		<li>Opzione 1: posizionare l'anello di plastica autoclavato al centro della capsula di Petri, quindi applicare la plastica liquida all'interno dell'anello; una goccia richiederà circa 100-200 μL di gocce di plastica liquida.</li>
		<li>Opzione 2: Applicare lo stesso numero di gocce di plastica liquida direttamente al centro della capsula di Petri senza utilizzare l'anello di plastica.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lasciare asciugare le stoviglie scoperte per 2-3 ore in una cappa a flusso laminare. Dopo l'asciugatura, esporre le stoviglie ai raggi ultravioletti per 20-30 minuti.</li>
</ol>
2. Trattamento delle piastre di coltura con gelatina
<ol>
	<li>Preparare una soluzione di gelatina allo 0,1% sciogliendo la gelatina in polvere in acqua distillata a 95 °C. Far passare la soluzione in sequenza attraverso filtri a membrana da 0,45 μm e 0,25 μm, quindi conservare il filtrato a 4 °C.</li>
	<li>Immediatamente prima della risemina dei condrociti, applicare i 3 mL di soluzione di gelatina sul pallone da 25 cm2 (si consiglia fino a 15 g di tessuto cartilagineo per pallone T25). Incubare a temperatura ambiente (RT) per 30 min, rimuovere la gelatina, sciacquare due volte con PBS e procedere con la semina cellulare.</li>
</ol>
3. Isolamento e coltivazione dei condrociti
NOTA: I condrociti sono isolati da regioni cartilaginee non portanti di pazienti sottoposti a sostituzione totale del ginocchio. Raccogliere tutti i campioni in condizioni sterili e conservarli in provette sterili riempite con DMEM contenenti 200 U/mL di soluzione di penicillina/streptomicina. Conservare il tessuto cartilagineo in frigorifero a 2-8 °C.
<ol>
	<li>Iniziare il trattamento enzimatico entro 2 giorni dal prelievo della cartilagine. Lavare i pezzi di cartilagine nella soluzione di Hanks utilizzando piastre di Petri da 60 mm, quindi tagliare la cartilagine in frammenti di circa 1-2 mm di diametro utilizzando forbici autoclavate.</li>
	<li>Trasferire i pezzi di cartilagine in provette da 15 mL e digerirli in una soluzione di collagenasi 0,01% di tipo II in DMEM, circa 1 mL per 1 g di cartilagine, entro 8-12 ore in un incubatore di CO2 impostato a 37 °C con 5% di CO2, 100% di umidità, in continua agitazione su un agitatore orbitale a 150-200 giri/min.</li>
	<li>Dopo la digestione, lavare i frammenti di cartilagine aggiungendo DMEM in una provetta da 15 mL, quindi centrifugare a 300 × g per 10 min. Risospendere i frammenti in un terreno di coltura di condrociti (Tabella supplementare 1) e seminarli su un pallone adesivo T25 pre-rivestito con una soluzione di gelatina allo 0,1%.</li>
	<li>Passaggio dei condrociti quando si raggiunge una densità confluente dell'80%.<ol>
		<li>Per il passaggio, lavare i condrociti con la soluzione di Hanks, quindi incubare le cellule con una soluzione di tripsina allo 0,25% a 37 °C per 5 minuti.</li>
		<li>Per inattivare la tripsina, aggiungere un volume uguale di DMEM + 10% FBS. Risospendere i condrociti in un terreno di coltura fresco, quindi distribuirli in un rapporto 1:3, seminando 20.000-30.000 cellule per 1 cm2.</li>
		<li>Porre il pallone di coltura in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 e il 100% di umidità.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Coltivazione di cellule staminali pluripotenti
NOTA: In collaborazione con il Laboratorio di Cellule Staminali del Molecular Brain Research Group, Dipartimento di Neurobiologia, A.I. Virtanen Institute, Università della Finlandia Orientale, Kuopio, Finlandia, è stata generata con successo una linea di iPSCs IPSRG4S in un precedente studio8.
<ol>
	<li>Coltivare iPSC in piastre a 6 pozzetti pre-rivestite con una matrice contenente proteine extracellulari (Figura 1A). Utilizzare un terreno per le cellule staminali pluripotenti (Tabella supplementare 1).</li>
	<li>Celle di passaggio all'80% di confluenza, mantenendo un rapporto 1:4 (50.000-75.000 celle per 1 cm2). Circa 2-3 ore prima del distacco, trasferire le iPSC nel terreno per cellule staminali pluripotenti contenenti l'inibitore della chinasi Rho Y27632 a una concentrazione finale di 1 μM per 1 giorno.</li>
	<li>Lavare le iPSC con la soluzione di Hanks e incubare a 37 °C con una soluzione di tripsina allo 0,05%. Per inattivare la tripsina, aggiungere un volume uguale di DMEM + 10% FBS. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 minuti in provette da 15 mL.</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un terreno fresco per ottenere cellule staminali pluripotenti. Per migliorare la vitalità cellulare, aggiungere l'inibitore della chinasi Rho Y27632 al terreno a una concentrazione finale di 1 μM per 1 giorno. Posizionare la piastra di coltura in un incubatore a CO2 impostato a 37 °C con il 5% di CO2 e il 100% di umidità.</li>
</ol>
5. Differenziamento condrogenico delle iPSC
<ol>
	<li>Avviare la differenziazione verso la linea condrocitica coltivando cellule nel terreno A (Tabella supplementare 1) per i primi 2 giorni. Il giorno 3, sostituire il terreno A con una soluzione che escluda Chir 99021 e l'inibitore della Rho chinasi mantenendo invariati tutti gli altri componenti. Cambiare il mezzo ogni 2 giorni dal giorno 3 al giorno 9 (Figura 1B).</li>
	<li>Il giorno 10, trasferire le cellule simili ai condrociti nel terreno B (Tabella supplementare 1), formulato per facilitare la condrogenesi. Cambiare il fluido ogni 2 giorni per 10 giorni (Figura 1C).</li>
	<li>Preparare in anticipo una piastra di coltura in sospensione cellulare da 96 pozzetti rivestendo ogni pozzetto con agarosio all'1,5% in acqua distillata. Sciogliere l'agarosio in un forno a microonde fino a ebollizione (circa 60-90 s a 700 W). Una volta liquefatto l'agarosio, aggiungere 75 μL di agarosio a ciascun pozzetto e lasciarlo indurire a RT (circa 15 minuti).</li>
	<li>Aggiungere 150 μl di terreno DMEM a ciascun pozzetto e incubare la piastra in un incubatore di CO2 per almeno 12 ore. NOTA: Le piastre preparate possono essere conservate per un massimo di 1 mese in un incubatore di CO2 a 37 °C se il terreno in ciascun pozzetto viene reintegrato per compensare l'evaporazione.</li>
	<li>Il giorno 12, dopo aver osservato i cambiamenti fenotipici associati alla condrogenesi, avviare la formazione di sferoidi utilizzando le cellule simili ai condrociti generate. NOTA: In questa fase, è consigliabile analizzare l'espressione di marcatori condrocitici chiave con immunocitochimica (ICC) e reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) utilizzando il metodo 2-ΔΔCT 9 per confermare il successo della differenziazione condrogenica delle iPSC. Durante il passaggio da una piastra a 6 pozzetti a un pallone per colture cellulari da 75 cm2 , una piccola porzione di cellule può essere seminata in una piastra a 48 pozzetti, in base al numero di marcatori da analizzare. Eseguire l'analisi ICC su questi campioni per verificare l'espressione genica.</li>
</ol>
6. Formazione di sferoidi da cellule derivate da iPSC simili ai condrociti
<ol>
	<li>Dopo aver ottenuto derivati simili ai condrociti, le cellule passano all'80% di confluenza. Staccare le cellule dalle piastre a 6 pozzetti utilizzando una soluzione di tripsina allo 0,05%. Per inattivare la tripsina, aggiungere un volume uguale di DMEM + 10% FBS, quindi trasferire le cellule in una provetta da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante, risospendere le cellule in 1 mL di terreno B e trasferirle in un pallone di coltura cellulare da 75 cm2 pre-rivestito con soluzione di gelatina allo 0,1% (Figura 1D). Una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza come monostrato, staccare nuovamente le cellule con la tripsina e risospendere nel terreno B come descritto.</li>
	<li>Trasferire le cellule in una piastra da 96 pozzetti rivestita con agarosio all'1,5% a una densità di 100.000 cellule per pozzetto. Coltivare nel terreno B, aggiungendo 150 μl di terreno completo per pozzetto (Figura 1D, 3A).</li>
	<li>Mantenere le cellule nella piastra a 96 pozzetti rivestite con agarosio all'1,5% per un minimo di 1 giorno e un massimo di 3 giorni fino alla formazione di sferoidi (Figura 2B). Trasferire gli sferoidi dai pozzetti utilizzando un puntale per pipetta da 1 mL con un'estremità tagliata, quindi trasferirli in una provetta da 15 mL. Lasciare riposare gli sferoidi per 2-3 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Immergere gli sferoidi in una soluzione di matrice a membrana basale appena scongelata e non diluita mantenuta a 4 °C. Dopo 30 minuti, raccogliere gli sferoidi per sedimentazione passiva in una provetta da 15 mL o per centrifugazione delicata a 100 x g per 1 minuto. NOTA: La matrice deve essere scongelata per una notte con ghiaccio in frigorifero a 2-8 °C. Dopo il primo scongelamento, vengono realizzate aliquote monouso della matrice per evitare ripetuti cicli di gelo-scongelamento. I tubi in polipropilene o altri tubi compatibili con il congelatore vengono utilizzati e conservati a -70 °C o -20 °C. Prestare attenzione alla data di scadenza del lotto/lotto, che è di 2 anni dalla data di produzione.</li>
	<li>Trasferire gli sferoidi nei mini-bioreattori e aggiungere 6 mL di terreno B. Posizionare il mini-bioreattore su un agitatore orbitale all'interno di un incubatore di CO2 impostato a 37 °C con il 5% di CO2 e il 100% di umidità e una velocità di agitazione di 70-75 giri/min (Figura 1F).</li>
	<li>Cambiare il terreno settimanalmente o come richiesto dall'esaurimento del medio o dal cambiamento di colore dell'indicatore acido-base. Per fare ciò, lasciare che gli sferoidi si depositino per gravità in una provetta da 15 mL, quindi rimuovere con cura il surnatante. Aggiungere il terreno B fresco al tubo e trasferire gli sferoidi ai mini-bioreattori.</li>
</ol>

<ol><li>Cieza, A., Causey, K., Kamenov, K., Hanson, S. W., Chatterji, S., Vos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+the+need+for+rehabilitation+based+on+the+Global+Burden+of+Disease+study+2019%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global estimates of the need for rehabilitation based on the Global Burden of Disease study 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> Lancet. 396, e10267(2021).</li>
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<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Articular+cartilage+repair+biomaterials%3A+Strategies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Articular cartilage repair biomaterials: Strategies and applications.</a> Materials Today Bio. 24, e100948(2024).</li>
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<li>Endo, K., Fujita, N., Nakagawa, T., Nishimura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fibroblast+growth+factor-2+and+serum+on+canine+mesenchymal+stem+cell+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effect of fibroblast growth factor-2 and serum on canine mesenchymal stem cell chondrogenesis.</a> Tissue Eng Part A. 25 (11-12), 901-910 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Soluzione di tripsina allo 0,05%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina allo 0,25%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12 Eagle's medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale aggrecano</td><td>Invitrogen</td><td>AHP0022</td><td>Ospite: Topo; Diluizione: 1/500</td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td>50 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>integratore di B-27</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>1x o 2%</td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanolo</td><td>Serva</td><td>28625</td><td>90 mM</td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-110-922</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-103-926</td><td>10 &mu; M</td></tr><tr><td>COL1A1 (E6A8E) Anticorpo monoclonale</td><td>CellSignalling</td><td>39952</td><td>Ospite: Coniglio; Diluizione: 1/800</td></tr><tr><td>COL2A1 (M2139) Anticorpo monoclonale</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-52658</td><td>Ospite: Topo; Diluizione: 1/50</td></tr><tr><td>Soluzione di collagenasi di tipo II&nbsp;</td><td>PanEco</td><td>P011-2</td><td>0,01%</td></tr> <tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-5MG</td><td>1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>di DMEM medio senza glutammina</td><td>PanEco</td><td>?420?</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>10%</td></tr><tr><td>La soluzione di Hanks&nbsp;</td><td>PanEco</td><td>?020?</td><td></td></tr><tr><td>Hybris 8 medium</td><td>PanEco</td><td>?780?/?780</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di insulina-transferrina-selenio</td><td>PanEco</td><td>?065</td><td>1x ha le seguenti concentrazioni: Insulina: 10 &; g/mL; Transferrina: 5,5 & micro; g/mL; Selenio 5 ng/mL</td></tr><tr><td>L-alanil-L-glutammina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific 35050038</td><td></td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>BD</td><td>354277</td><td>300 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina</td><td>PanEco</td><td>?063?</td><td>100 U/mL</td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-117-339</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Inibitore della chinasi Rho Y27632</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-103-922&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario Capra anti-topo IgG (H+L) Cross-Adsorbed, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A21422</td><td>Ospite: Capra; Diluizione: 1/500</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario capra anti-coniglio IgG (H + L) altamente adsorbito in modo incrociato, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher Scientific.</td><td>?32732</td><td>Ospite: Capra; Diluizione: 1/500</td></tr><tr><td>Sox9 (D8G8H) Anticorpo monoclonale</td><td>CellSignalling</td><td>82630</td><td>Ospite: Rb; Diluizione: 1/400</td></tr><tr><td>TeSR-1 medium</td><td>STEMCELL technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-095-067</td><td>10 ng/mL</td></tr></tbody></table>

generazione di sferoidi da vari condrociti utilizzando condizioni di bassa adesività per gravità e mini-bioreattori fatti in casa

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

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Generazione di sferoidi da vari condrociti utilizzando condizioni di bassa adesività per gravità e mini-bioreattori fatti in casa

Cartilage repair in chronic joint diseases demands advanced cell-based therapies to regenerate damaged tissues effectively. This protocol provides a ...

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La riparazione della cartilagine rappresenta una sfida medica insoddisfatta e gli approcci basati sulle cellule per ingegnerizzare la cartilagine articolare umana sono una soluzione promettente. Qui, descriviamo gli idrogel biomimetici tridimensionali (3D) come uno strumento ideale per l'espansione e la maturazione dei condrociti articolari umani.

3D Hydrogel Ponteggi per articolare condrociti, Cultura e Cartilagine Generation

Lo stress meccanico può indurre la differenziazione condrogenica delle cellule staminali, fornendo un potenziale approccio terapeutico per la riparazione della cartilagine compromessa. Presentiamo un protocollo per indurre la differenziazione condrogenica di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) utilizzando la gravità centrifuga (CG). L'upregolazione di SOX9 indotta dalla CG porta allo sviluppo di fenotipi condrogenici.

Condrogenico Differenziazione induzione di cellule staminali derivate da tessuto adiposo per gravità centrifuga

Questo articolo fornisce metodi dettagliati per la fabbricazione e la caratterizzazione di un dispositivo microfluidico azionato retice per la compressione condrocitica.

Una piattaforma microfluidica per stimolare i condrociti con la compressione dinamica

Vi presentiamo un dispositivo microfluidico centricomotore a motore in grado di coltivare sferoidi cellulari. Utilizzando questo dispositivo, sferoidi di tipo cellulare singolo o multiplo potrebbe essere facilmente costati in condizioni di alta gravità.

Piattaforma lab-on-a-CD per la generazione di spheroid tridimensionali multicellulari

Qui, descriviamo la produzione su larga scala di sferoidi stromali / cellule staminali (ASC) di derivazione adiposa utilizzando un sistema di pipettaggio automatizzato per seminare la sospensione cellulare, garantendo così l'omogeneità delle dimensioni e della forma dello sferoide. Questi sferoidi ASC possono essere utilizzati come elementi costitutivi per approcci di bioprinting 3D.

Produzione automatizzata su larga scala di sferoidi a cellule staminali di derivazione adiposa per la bioprinting 3D

Il presente protocollo descrive una tecnica per produrre sferoidi tissutali su larga scala in modo economico utilizzando un dispositivo simile a un timbro stampato in 3D.

Generazione di sferoidi tissutali tramite un dispositivo simile a un timbro stampato in 3D

Questo protocollo descrive in dettaglio l'isolamento dei condrociti, dei condroprogenitori derivati dal dosaggio di adesione della fibronectina (FAA-CP) e dei condroprogenitori migratori (MCP) dalla cartilagine articolare umana. Copre la digestione enzimatica, l'adesione della fibronectina e i saggi basati sulla migrazione per isolare e caratterizzare queste cellule.

Isolamento di condrociti e condroprogenitori mediante adesione della fibronectina e saggio migratorio

Questo studio presenta una metodologia economica ed efficiente per generare strutture cellulari 3D utilizzando un sistema basato su timbri per creare micropozzetti in stampi di agarosio. Il sistema promuove la formazione di sferoidi/organoidi uniformi, migliorando così le interazioni cellulari. Questo approccio riduce la variabilità sperimentale e supporta le applicazioni nei test sui farmaci e nell'ingegneria tissutale.

Generazione di sferoidi/organoidi tridimensionali da colture cellulari bidimensionali utilizzando un nuovo dispositivo di timbro

Scopri come generare sferoidi condrocitari da cellule iPSC in condizioni di bassa adesività utilizzando mini-bioreattori. Questo metodo scalabile migliora le strategie di riparazione della cartilagine nelle malattie articolari croniche.

Generazione di sferoidi da vari condrociti utilizzando condizioni di bassa adesività per gravità e mini-bioreattori fatti in casa (Video) | JoVE Journal

Generazione di sferoidi da vari condrociti utilizzando condizioni di bassa adesività per gravità e mini-bioreattori fatti in casa

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