Generazione di sferoidi da vari condrociti utilizzando condizioni di bassa adesività per gravità e mini-bioreattori fatti in casa

La riparazione della cartilagine nelle malattie articolari croniche richiede terapie cellulari avanzate per rigenerare efficacemente i tessuti danneggiati. Questo protocollo fornisce un metodo passo-passo per differenziare le cellule staminali pluripotenti indotte in sferoidi basati su condrociti, supportando le applicazioni di ingegneria tissutale e terapia cellulare. La riparazione della cartilagine nelle malattie articolari croniche richiede terapie cellulari avanzate per rigenerare sufficientemente i tessuti danneggiati.

Questo protocollo fornisce un metodo passo-passo per differenziare le cellule staminali pluripotenti indotte in sferoidi basati su condrociti, supportando le applicazioni di ingegneria tissutale e terapia cellulare. Le sfide principali sono la riduzione al minimo dell'espressione del collagene di tipo uno nelle cellule derivate da iPSC per prevenire la cartilagine fibrosa, la creazione di condizioni per la formazione di cartilagine highline matura, il miglioramento dei metodi di coltura 3D per la stabilità degli sferoidi e lo sviluppo di approcci scalabili per la produzione di volumi clinici di materiale cellulare. Il protocollo offre un vantaggio utilizzando le iPSC come fonte alternativa di condrociti, consentendo una produzione scalabile senza procedure invasive.

Garantisce un migliore mantenimento del fenotipo dei condrociti attraverso la coltura 3D e imita lo sviluppo naturale della cartilagine, ottenendo cellule molto simili ai condrociti nativi con un'elevata espressione di marcatori specifici della cartilagine. Sviluppare metodi efficaci per migliorare la maturità e la funzionalità dei condrociti derivati da iPSC, garantire la stabilità a lungo termine in vivo, creare materiali di coltura tridimensionali fibrosi e sviluppare una produzione scalabile di materiale cellulare per applicazioni cliniche. Per iniziare, sterilizzare le forbici in un'autoclave impostata a 121 gradi Celsius a 15 libbre per pollice quadrato per 30 minuti.

Dopo che le forbici si sono asciugate, tagliare le provette da centrifuga in anelli alti da sette a otto millimetri. Ora schiacciare le piastre di Petri a bassa adesione, non trattate o microbiologiche in piccoli pezzi utilizzando uno strumento di frantumazione appropriato. Sciogliere circa un grammo di particelle di plastica in 10 millilitri di cloroformio per una notte all'interno di una cappa aspirante.

Verificare la viscosità della soluzione di plastica liquida per assicurarsi che sia adatta al pipettaggio. Se la soluzione è troppo liquida, aggiungi da uno a tre grammi di particelle di plastica aggiuntive. Se diventa troppo denso, diluirlo con circa cinque millilitri di cloroformio.

Posizionare un anello di plastica per autoclave al centro di una piastra di Petri da 60 millimetri. Quindi applicare della plastica liquida all'interno dell'anello per formare una manopola di plastica. Lasciare asciugare i piatti scoperti in una cappa a flusso laminare per due o tre ore.

Dopo l'asciugatura, esporre le stoviglie alle radiazioni ultraviolette per 20-30 minuti. Per iniziare, procuratevi le piastre di Petri modificate contenenti le manopole di plastica. Due giorni dopo il prelievo della cartilagine, lavare i pezzi di cartilagine nella soluzione di Hank utilizzando piastre di Petri da 60 millimetri.

Quindi tagliare la cartilagine in frammenti di circa uno o due millimetri di diametro usando le forbici per autoclave. Trasferire i pezzi di cartilagine in una provetta da 15 millilitri e digerirli in una soluzione di collagenasi di tipo 2 allo 0,01% in DMEM per otto-12 ore in un incubatore con agitatore orbitale. Dopo la digestione, aggiungere i frammenti di cartilagine con DMEM e centrifugare la provetta a 300 G per 10 minuti.

Dopo aver scartato la soluzione di lavaggio, risospendere i frammenti in un terreno di coltura di condrociti e seminarli su un pallone adesivo T25 pre-rivestito con soluzione di gelatina allo 0,1% e incubare. Successivamente, coltivare cellule staminali pluripotenti indotte in piastre a sei pozzetti pre-rivestite con una matrice contenente proteine extracellulari. Per avviare la differenziazione verso la linea condrocitica, coltivare iPSC nel terreno A per i primi due giorni.

Il terzo giorno, sostituire il terreno A con una soluzione che escluda CHIR-99021 e l'inibitore della rho-chinasi mantenendo invariati tutti gli altri componenti. Il giorno 10, trasferire le cellule simili ai condrociti al terreno B formulato per facilitare la condrogenesi, quindi sciogliere l'1,5% di argarose in un forno a microonde per circa 60-90 secondi a 700 watt. Una volta liquefatto, aggiungere 75 microlitri di agarosio a ciascun pozzetto di una piastra di coltura in sospensione cellulare a 96 pozzetti e lasciarlo indurire a temperatura ambiente.

Successivamente, aggiungere 150 microlitri di DMEM a ciascun pozzetto e incubare la piastra in un incubatore ad anidride carbonica per almeno 12 ore. Il giorno 12, osservare i cambiamenti fenotipici associati all'androgenesi per procedere all'inizio degli sferoidi. Staccare le cellule all'80% di confluenza dalla piastra utilizzando una soluzione di tripsina allo 0,05%.

Dopo aver aggiunto volumi uguali di DMEM con il 10% di FBS, trasferire le cellule in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a 200 G per cinque minuti. Risospendere le cellule in un millilitro di terreno B e trasferirle in un pallone di coltura cellulare di 75 centimetri quadrati pre-rivestito con soluzione di gelatina allo 0,1%. Una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza come monostrato, staccarle nuovamente con tripsina e risospenderle nel terreno B.Ora erogare le cellule in una piastra a 96 pozzetti rivestita con agarosio all'1,5% a una densità di 100.000 cellule per pozzetto, insieme a 150 microlitri di terreno B.Incubare le cellule per un minimo di un giorno e un massimo di tre giorni fino alla formazione degli sferoidi.

Quindi trasferire gli sferoidi dai pozzetti utilizzando una punta per pipetta da un millilitro con un'estremità tagliata in una provetta da 15 millilitri. Lascia riposare gli sferoidi per due o tre minuti e rimuovi il surnatante. Ora immergi gli sferoidi in una soluzione di matrice di membrana basale appena scongelata e non diluita temperata a quattro gradi Celsius.

Dopo 30 minuti, centrifugare la provetta a 100 G per un minuto per raccogliere gli sferoidi. Infine, trasferire gli sferoidi nei mini bioreattori preparati e aggiungere sei millilitri di mezzo B.Posizionare il mini bioreattore all'interno di un incubatore di anidride carbonica. Dopo 19 giorni di differenziazione, il 99% delle cellule esprimeva marcatori condrogenici aggrecan, collagene di tipo uno, collagene di tipo due e SOX9.

Le condrosfere di alta qualità sono state identificate come quelle con almeno il 90-95% di espressione di marcatori genici condrocitici, valutate attraverso l'analisi dell'espressione genica al giorno 30 di differenziazione. Gli sferoidi maturi hanno mostrato una morfogenesi costante, crescendo fino a un diametro tipico di uno o due millimetri dopo due mesi, con sferoidi più grandi che mostrano zone centrali con carie o necrosi.