Name: Un flusso di lavoro rapido e semplice per la quantificazione delle strutture esterne di Drosophila adulta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Scopri un protocollo di imaging a basso costo per quantificare i difetti di crescita negli occhi di Drosophila adulta. Questo metodo offre un'alternativa accessibile alla microscopia elettronica per studiare la biologia del cancro.

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1. Raccolta e fissazione della Drosophila adulta
<ol>
	<li>Prepara le croci di Drosophila o seleziona i ceppi e mettili in fiale contenenti cibo per mosche. Incubare le fiale alla temperatura desiderata (di solito 25 °C) fino a quando le mosche non si sono sviluppate e gli adulti si sono chiusi (~10-14 giorni a 25 °C).</li>
	<li>Anestetizzare le mosche con CO2 e posizionarle su un tampone CO2 .</li>
	<li>Ordina le mosche con una piuma e seleziona gli individui con il fenotipo desiderato (ad esempio, ali dritte). Crea una selezionatrice di mosche di piume tagliando una piuma d'oca per adattarla all'estremità affusolata di una pipetta sierologica da 1 ml.</li>
	<li>Preparare una provetta da microcentrifuga da 1,7 mL con 1 mL di etanolo al 70%. Metti le mosche selezionate nella provetta della microcentrifuga e metti sul ghiaccio. Conservare le provette per microcentrifuga a 4 °C per una notte (Figura 2A). NOTA: Non conservare le mosche in etanolo per più di 24 ore. La conservazione a lungo termine delle mosche in etanolo al 70% comporterà la perdita di pigmento per gli occhi e il corpo.</li>
</ol>
2. Preparazione del campione mediante montaggio puntuale
NOTA: Le Drosophila sono insetti dal corpo molle che diventano fragili e collassano quando vengono essiccati all'aria; Pertanto, questo protocollo richiede che i campioni vengano ripresi lo stesso giorno in cui vengono montati. Lavorare in piccoli gruppi di ~5 mosche alla volta per evitare la perdita di campione. Aumenta il numero di campioni in un set in base all'efficienza. I campioni che richiedono più tempo prima dell'imaging possono essere disidratati attraverso una serie di concentrazioni crescenti di esametiltililazano (HMDS)14.
<ol>
	<li>Taglia piccole punte triangolari (7,1 mm x 2,7 mm) da cartoncino d'archivio da 65 libbre utilizzando un punzone specializzato. Preparare le punte piegando la punta (la più stretta del 25%) a un angolo di 90° con le pinze a punta fine Dumont #5 (Figura 2B).</li>
	<li>Utilizzando la pinza a punta fine Dumont #5, rimuovere le mosche dalle provette per microcentrifuga (passaggio 1.4). Tampona delicatamente le mosche con un panno di laboratorio privo di lanugine per rimuovere l'etanolo in eccesso. Posiziona ogni mosca sul lato sinistro su una scheda sotto un microscopio da dissezione. NOTA: Rimuovere le mosche dal tubo tenendolo per una struttura anatomica che non sia l'area di interesse: durante l'imaging della testa, teniamo i campioni per l'ala o la zampa. Non tenere i campioni per l'addome, poiché quella struttura viene utilizzata per incollare la mosca sulla punta della carta.</li>
	<li>Preparare la colla per pelli, regolandone la consistenza alla viscosità desiderata. Mescolare 1-2 gocce di colla per pelli con 1-2 gocce di acqua deionizzata (DI) e mescolare con una pipetta di trasferimento su una scheda. Raccogli una punta di carta preparata all'estremità larga con una pinza e posiziona una piccola quantità di colla diluita sulla punta piegata della punta tamponandola nella miscela di colla e acqua (Figura 2C). NOTA: La colla deve essere spalmabile ma non liquida.</li>
	<li>Applicare la punta piegata della punta sul lato anteriore dell'addome destro attorno ai segmenti addominali 2-3 (Figura 2C). Prima che la colla si asciughi, apportare lievi modifiche alla mosca in modo tale che l'asse antero-posteriore della mosca sia perpendicolare alla punta piegata della punta.</li>
	<li>Inserire un perno di montaggio n. 3 nell'estremità larga della punta della scheda (Figura 2D) e fissarlo a un blocco di fissaggio per insetti (Figura 2E). Etichetta ogni spillo o fila di spilli con il genotipo corrispondente.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig02.jpg"> 
Figura 2: Preparazione del campione. (A) Le Drosophila adulte vengono selezionate in base a marcatori fenotipici e raccolte in provette da microcentrifuga marcate contenenti il 70% di etanolo su ghiaccio. Le mosche vengono conservate a 4° C durante la notte. (B) I punti della carta di carta vengono preparati piegando l'estremità stretta di 90° dal resto della carta utilizzando un paio di pinze #5. (C) Le mosche vengono recuperate dai tubi e lasciate asciugare brevemente all'aria. La colla di pelle viene applicata all'estremità piccola e piegata della punta della carta preparata e incollata alla mosca adulta ai segmenti addominali 2-3. (D) Gli esemplari sono montati, con un'etichetta di identificazione, su un perno per insetti in acciaio inossidabile #3. (E) I campioni appuntati vengono conservati su una scheda campione fino al momento dell'acquisizione dell'immagine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
3. Acquisizione di immagini con focus stacking ad alta risoluzione
<ol>
	<li>Acquisisci fotografie ad alta risoluzione degli occhi delle mosche con un sistema di imaging focus stacking assemblato e personalizzato.<ol>
		<li>Scatta fotografie con un corpo macchina DSLR con un teleobiettivo da 70-200 mm collegato a un obiettivo per microscopio Apo 20x tramite un adattatore per obiettivo da 77 mm.</li>
		<li>Assicurarsi che il campione sia illuminato con un flash attraverso un diffusore (Figura 3).</li>
		<li>Controlla il posizionamento Z utilizzando un controller Stackshot e una guida macro.</li>
		<li>Collega la fotocamera, il flash e il tavolino motorizzato a un treppiede in alluminio anodizzato per impieghi gravosi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posiziona ogni campione montato su un gimbal a tavolino universale con la testa orientata in modo che l'occhio sia rivolto verso l'obiettivo. Effettuare le regolazioni della posizione della testa muovendo delicatamente la testa con la pinza. ATTENZIONE: Regolazioni grandi e rapide possono provocare la decapitazione accidentale.</li>
	<li>Con la fotocamera collegata a un computer portatile, regolare le impostazioni di acquisizione nel software. Fotografa i campioni con un ingrandimento di 20x con queste impostazioni: Potenza flash 1/32, Velocità dell'otturatore 1/200, Apertura F2.8 e ISO 400. Assicurarsi che tutte le funzioni di messa a fuoco automatica e stabilizzazione dell'immagine siano disattivate. NOTA: Queste impostazioni bilanciano l'illuminazione ottimale del flash, la velocità dell'otturatore e la profondità di campo. Dovrebbero essere regolati per altri ingrandimenti e/o combinazioni di lenti.</li>
	<li>Impostare la posizione per il salvataggio della pila di immagini risultante (10-50 immagini) nella cartella di file desiderata. Garantire una capacità di archiviazione sufficiente per le immagini (~8,5 MB per immagine).</li>
	<li>Regolare le impostazioni della sequenza di messa a fuoco sull'unità di controllo Stackshot in modalità Distanza automatica.<ol>
		<li>Impostare la dimensione del passo su 5 μm e calcolare il numero di passi impostando le posizioni di avvio e di arresto dello stack di messa a fuoco.</li>
		<li>Visualizzare il campione in modalità LiveView e con la fotocamera in modalità di scatto automatico per identificare le posizioni di inizio e fine.</li>
		<li>Spostare il binario in modo che la parte più vicina del campione sia a fuoco (impostare la posizione iniziale ), quindi spostarsi nel punto in cui è a fuoco la caratteristica più lontana di interesse (impostare la posizione finale ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Riportare la fotocamera alla modalità di scatto manuale e avviare l'acquisizione dell'immagine dall'unità di controllo Stackshot. NOTA: Il tempo di acquisizione dell'immagine dipende dalle dimensioni del campione. Maggiore è la profondità di campo necessaria per campioni di grandi dimensioni, più sezioni sono incluse nella pila di immagini, il che prolungherà il tempo di acquisizione complessivo.</li>
	<li>Aprire i file nel software di focus stacking di riferimento. Generare un'immagine impilata facendo clic su Impila | Allinea e impila tutto (PMax).</li>
	<li>Salvare l'immagine finale sul disco rigido del computer come file .tif facendo clic su File | Salva l'immagine di output. NOTA: A seconda della risoluzione del file di immagine impilato e del numero di campioni di cui è stata creata l'immagine, potrebbero essere necessari dischi rigidi esterni di grandi dimensioni (1 TB) per il backup dell'immagine. In questo protocollo, le immagini impilate sono di circa 100 MB ciascuna prima di essere compresse.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig03.jpg"> 
Figura 3: Acquisizione dell'immagine. (A) Apparecchio di imaging con parti etichettate come segue: a) Corpo della fotocamera DSLR; b) teleobiettivo; c) Obiettivo e adattatore per microscopio Apo 20x; d) Flash; e) Diffusori a lente e a cupola; f) Stackshot Controller, Macro Rail e Rotary Stage; g) Gimbal da palco universale; h) Treppiede. (B) Apparecchio di imaging con diffusore di luce in posizione. (C) Primo piano del campione montato in posizione per l'imaging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
4. Flusso di lavoro di analisi FIJI per calcolare l'area oculare degli adulti
<ol>
	<li>Per l'analisi delle immagini, ottenere il software FIJI15 dal sito Web ImageJ.net.</li>
	<li>Scegli immagini per l'analisi in cui l'occhio è centrato e allineato con un'illuminazione adeguata e una sfocatura periferica minima, indicando il corretto allineamento con la fotocamera.</li>
	<li>Calibrare la scala dell'immagine.<ol>
		<li>Scarica l'immagine della barra della scala per un ingrandimento 20x correlato a 500 μm. In alternativa, al momento dell'acquisizione dell'immagine, fotografare un righello utilizzando le stesse impostazioni. Apri l'immagine nel software FIJI.</li>
		<li>Misurare la lunghezza della barra della scala (Figura 4A). Usa lo strumento Linea retta per tracciare esattamente la linea. Fare clic su Analizza | Misurare. Questa distanza di pixel è equivalente a 500 μm (Figura 4B).</li>
		<li>Calcola i pixel per micron. Utilizzare questa opzione per convertire le misurazioni dei pixel in misurazioni micrometriche.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aprire il file immagine impilato in FIJI (Figura 4C).</li>
	<li>Seleziona Lente di ingrandimento dalla barra degli strumenti per ingrandire l'area di messa a fuoco. Provare a riempire lo schermo con l'occhio e la cuticola della testa immediatamente circostante (Figura 4D).</li>
	<li>Seleziona lo strumento di selezione a mano libera dalla barra degli strumenti. Delineare l'area retinica il più fedelmente possibile, seguendo i contorni della fila più esterna di ommatidi (Figura 4E). Per rimuovere parte della selezione, tieni premuto il pulsante di opzione e seleziona i pixel da rimuovere. Per aggiungere alla selezione, tieni premuti i pulsanti opzione e Maiusc e seleziona i pixel da aggiungere.</li>
	<li>Per calcolare l'area, selezionare Analizza | Misurare dal menu in alto (Figura 4F). Apparirà una nuova finestra con i parametri area, media, minimo e massimo . Copia e incolla questi dati in un foglio di calcolo per la documentazione e la conversione da pixel a misurazioni micrometriche.</li>
	<li>Eseguire analisi statistiche appropriate.</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig04.jpg"> 
Figura 4: Analisi dell'immagine nelle FIJI. (A) Ridimensionare l'immagine originale. Scarica l'immagine di calibrazione e misura la lunghezza della barra da 500 μm. (B) Regolare la scala utilizzando la funzione Imposta scala . (C) Aprire l'immagine impilata. (D) Ingrandisci l'immagine in modo che l'occhio sia centrato e quasi a schermo intero. (E) Utilizzare lo strumento Selezione a mano libera per delineare l'occhio al confine tra la fila più esterna di ommatidi e la cuticola circostante. (F) Misurare l'area all'interno della regione selezionata viene calcolata facendo clic su Analizza | Misura | Area. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Imaging e analisi ad alta risoluzione dei difetti oculari di Drosophila

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<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li>
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</ol>

La Drosophila melanogaster è un potente organismo modello genetico che è stato utilizzato per decenni per chiarire le vie di segnalazione molecolare e i comportamenti cellulari. Molte delle vie di segnalazione evolutivamente conservate che sono essenziali per lo sviluppo multicellulare sono state identificate per la prima volta e il loro meccanismo d'azione definito in Drosophila. Circa il 65-75% di tutti i geni umani associati alla malattia ha ortologhi in Drosophila 1,2. L'occhio adulto di Drosophila è un modello importante che ha permesso di effettuare screening genetici imparziali che hanno facilitato la scoperta di importanti geni conservati implicati nelle malattie umane, tra cui il cancro 3,4, la neurodegenerazione5 e i disturbi metabolici6.
L'occhio di Drosophila è composto da ~800 occhi unitari, chiamati ommatidi, che sono disposti con precisione in uno schema esagonale sulla superficie dell'occhio adulto7. Ogni ommatidio è composto da otto neuroni fotorecettori che occupano una posizione distinta all'interno di un trapezio asimmetrico. Questi sono supportati da quattro cellule coniche non neurali e due cellule pigmentate primarie che secernono cristallino e pseudo-cono per focalizzare la luce sui rabdomeri sensibili alla luce dei neuroni fotorecettori. Gli ommatidi vicini sono separati da una singola fila di cellule reticolari interommatidiali, costituite da cellule di pigmento secondario, cellule di pigmento terziarie e complessi di setole meccanosensoriali 8,9,10.
Le perturbazioni nello sviluppo dell'occhio sono visibili negli occhi adulti come aumento o diminuzione delle dimensioni dell'occhio, abbondanza o struttura anormale di lenti o setole, o come un "occhio ruvido" in cui il modello esagonale normalmente invariante è interrotto in modo tale che una fila di ommatidi non può più essere seguita attraverso la superficie dell'occhio. Questi fenotipi possono essere valutati a livello di tessuto grossolano utilizzando microscopi da dissezione. L'analisi dettagliata dei fenotipi include tradizionalmente la microscopia elettronica a scansione seguita dall'analisi quantitativa delle immagini11. Tuttavia, la microscopia elettronica a scansione richiede strumentazione costosa, reagenti costosi, preparazione del campione che dura giorni e, spesso, personale a tempo pieno per la manutenzione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Flusso di lavoro per l'imaging delle strutture adulte di Drosophila . (A) Raccogliere e fissare la Drosophila adulta in etanolo al 70%. (B) Preparare i campioni per l'imaging mediante montaggio puntuale e fissaggio ai pin. (C) Acquisizione di immagini ad alta risoluzione tramite focus stacking e integrazione. (D) Quantificare le immagini utilizzando le FIJI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Questo documento presenta un flusso di lavoro relativamente economico, con un breve tempo di preparazione del campione, può essere facilmente installato su un banco da laboratorio di 3 piedi, non richiede materiali pericolosi e potrebbe essere un'aggiunta di lunga durata ai laboratori di ricerca sulla Drosophila (Figura 1). Il montaggio a punta è una tecnica entomologica utilizzata per essiccare all'aria e conservare piccoli insetti dal corpo molle, come la Drosophila12. Questo metodo si basa sulla combinazione di obiettivi per microscopio con fotocamere DSLR ad alta risoluzione per ingrandimenti efficaci da 10x a 1.000x. La limitata profondità di campo inerente alla macrofotografia è superata dal focus stacking: cucendo insieme una serie di immagini con il piano focale che si muove attraverso il campione di interesse13. Questo metodo produce immagini ad alta risoluzione adatte alla quantificazione dei fenotipi e potrebbero essere facilmente adattate per altre strutture di interesse, come l'ala, la zampa, il torace e l'addome. Il flusso di lavoro di analisi delle immagini utilizza il programma gratuito di analisi delle immagini FIJI (NIH ImageJ). Questa metodologia rende la preparazione dei campioni, l'imaging ad alta risoluzione e l'analisi accessibili a studenti universitari e scienziati di istituzioni con risorse insufficienti.

<table><tbody><tr><td>Pipetta sierologica da 1 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>170353N</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,7 ml</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-282LR</td><td></td></tr><tr><td>20x Apo Microscopio Obiettivo</td><td>Mitutoyo Corp.</td><td>378-804-3</td><td></td></tr><tr><td>Archivio 65 libbre di cartoncino&nbsp;</td><td>Neenah, Inc.</td><td>91901</td><td></td></tr><tr><td>Canon EF 70-200 mm USM II teleobiettivo</td><td>Canon</td><td>3044C002</td><td></td></tr><tr><td>Canon EOS 6D Mark II DSLR corpo macchina Canon</td><td></td><td>1897C002</td><td></td></tr><tr><td>Diffusore Dome</td><td>Soluzioni macroscopiche&nbsp;</td><td>Diffusore PA-DIF-GIM-SM</td><td></td></tr><tr><td>per Mitutoyo M Plan APO Obiettivi</td><td>Soluzioni Macroscopiche&nbsp;</td><td>mitutoyo-diffusori</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila fiale e tappi</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>32-117BF</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinze a punta fine</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9889584</td><td></td></tr><tr><td>Piume d'oca</td><td>Amazon</td><td>B01CMMJI6U</td><td></td></tr><tr><td>Treppiede in alluminio anodizzato per impieghi gravosi</td><td>Really Right Stuff, LLC</td><td>TFA-32G</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td> Fotocamera <td></td></tr><tr><td>digitale Levenhuk M1000 Plus</td> in tessuto di laboratorio privo di lanugine <td>Levenhuk</td><td>70358</td><td></td></tr><tr><td>No. 3 perno di montaggio</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-3</td><td></td></tr><tr><td>Nutri-Fly Bloomington Drosophila media</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>66-113</td><td>cibo per mosche</td></tr><tr><td>Point-Punch</td><td>M.C. Mieth Manufacturing, Inc.</td><td>448Dettaglio</td><td></td></tr><tr><td>Morsetto a vite</td><td>Really Right Stuff, LLC</td><td>SK-Clamp</td><td>Per il fissaggio della guida macro al treppiede</td></tr><tr><td>Stackshot Controller e Macro Rail</td><td>Cognisys Inc.</td><td></td><td></td>ST3X_100_BUNDLE</tr><tr><td>Adattatore ad anello step-down&nbsp;</td><td>RAF Camera</td><td>763461174207</td><td>Adattatore per obiettivo per collegare l'obiettivo del microscopio all'obiettivo della fotocamera</td></tr><tr><td>Titebond Colla</td><td>Franklin International</td><td>5013</td><td></td></tr><tr><td>Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite Flash</td><td>Shenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co.</td><td>YN-24EX</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canon EOS Utility (v. 3.16.1).&nbsp;</td><td>Il software</td> <td>di acquisizione Canon</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>Fiji è rilasciato come open source sotto la GNU General Public License. FIJI Versione 2.14.0/1.54f&nbsp;</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software, Boston, Massachusetts USA</td><td></td><td>Prism Versione 10.3.1</td></tr><tr><td>Zerene Stacker (v.1.04)</td><td>Zerene Systems, LLC</td><td></td><td>Focus Stacking Software</td></tr></tbody></table>

un flusso di lavoro rapido e semplice per la quantificazione delle strutture esterne di drosophila adulta

A Rapid, Simple Workflow for Quantification of External Adult Drosophila Structures

L'occhio di Drosophila è un eccellente sistema modello per lo studio del pattern tissutale, del controllo della crescita e della morte cellulare. Di recente abbiamo pubblicato uno studio che indaga su come il pH intracellulare (pHi) influenzi la crescita dei tessuti. In primo luogo, abbiamo stabilito un sistema genetico in cui la sovraespressione dello scambiatore sodio-protone DNhe2 (l'ortologo di NHE1 nei mammiferi) nell'occhio in via di sviluppo causa difetti di patterning e aumento della proliferazione16. Un aumento della proliferazione con pHi più elevato è stato osservato in tutte le specie, dai lieviti ai mammiferi17. Tuttavia, abbiamo anche osservato che con l'aumento del pHi, l'occhio adulto appariva di dimensioni più piccole rispetto ai controlli.
L'analisi quantitativa dell'area oculare adulta è stata eseguita per determinare in che modo l'elevata espressione di DNhe2 riduce le dimensioni del tessuto nell'occhio di Drosophila . Per prima cosa abbiamo acquisito immagini a bassa risoluzione utilizzando un microscopio a inserto oculare (Figura 5A), ma queste erano di qualità insufficiente per eseguire misurazioni quantitative. In particolare, i bordi dell'occhio non sono a fuoco, impedendo così una misurazione accurata della zona degli occhi.
Abbiamo misurato l'area di ciascun occhio in immagini ad alta risoluzione di occhi adulti di Drosophila (Figura 5B). I moscerini che esprimono GMR&gt;DNhe2 avevano occhi significativamente più piccoli (media 74,28 μm2) rispetto ai moscerini di controllo genetico w1118 (media 125,83 μm2) o al controllo del driver GMRGAL4 mosche eterozigoti (media 142,49 μm2), che è una riduzione rispettivamente del 41% e del 48% dell'area (Figura 5C). Questa diminuzione delle dimensioni degli occhi, nonostante l'aumento della proliferazione, potrebbe essere attribuita a livelli elevati di morte cellulare.
I geni noti dell'autofagia, tra cui Atg1, che induce la formazione di fagofori, sono stati utilizzati negli studi di interazione genetica (Figura 5). Gli effetti sulle dimensioni degli occhi degli adulti sono stati quantificati utilizzando la fotografia ad alta risoluzione e l'analisi dell'area (Figura 5B). La dimensione dell'occhio è stata ripristinata (129,9 μm2 vs 74,28 μm2) nei moscerini GMR&gt;DNhe2 eterozigoti per Atg13 rispetto a GMR&gt;DNhe2 da solo ed era simile ai controlli (Figura 5C). In combinazione con l'analisi dei marcatori molecolari, i nostri risultati supportano un aumento della morte cellulare autofagica a pHi più elevato.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig05.jpg"> 
Figura 5: Salvataggio della diminuzione delle dimensioni della retina associata a un aumento del pH intracellulare con diminuzione dell'autofagia. (A) Immagini a bassa risoluzione di occhi di mosca adulti scattate con un microscopio a inserto oculare. (B) Immagini ad alta risoluzione di occhi di mosca adulti utilizzate per la quantificazione delle dimensioni degli occhi per i seguenti genotipi: w1118; GMRGAL4; GMR&gt;DNhe2; GMRGAL4; ATG13; GMR&gt;DNhe2; ATG13. (C) Le dimensioni medie degli occhi degli adulti misurate erano: w1118 (125,83 μm2, N = 7); GMRGAL4 (142,49 μm2, N = 9) e GMR&gt;DNhe2 (74,28 μm2, N = 6), GMRGAL4; Atg13 (146,4 μm2, N = 15); GMR&gt;DNhe2; Atg13 (129,9 μm2, N = 19) e indicato mostrando valori mediani con intervalli interquartili. La significatività statistica è stata determinata da t-test non accoppiati con la correzione di Welch. I dati in B e C sono stati precedentemente pubblicati18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Le nostre conclusioni sono rafforzate dalla preparazione del campione, dall'imaging ad alta risoluzione e dall'analisi qui descritta. Questi metodi hanno permesso di ottenere una descrizione precisa e quantitativa delle dimensioni degli occhi adulti di Drosophila con vari genotipi. Stiamo continuando a utilizzare questo approccio per valutare altre interazioni genetiche che chiariranno i meccanismi del controllo della crescita pH-dipendente.

Un flusso di lavoro rapido e semplice per la quantificazione delle strutture esterne di Drosophila adulta

The Drosophila compound eye is a precisely patterned tissue that has revealed molecular mechanisms and biological processes that drive morphogenesis. It ...

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