Name: Preparazione di proiettili pistola Gene e Biolistic Transfection dei neuroni in cultura Slice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: Impara la preparazione di proiettili pistola genica rivestiti di DNA e la trasfezione biolistica di neuroni in fette ippocampali di ratto coltivate. Questo metodo consente la visualizzazione di singoli neuroni con uno sfondo pulito.

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Vorremmo ringraziare Mark Lucanic e Hwai-Jong Cheng aiuto per acquisire le immagini a basso ingrandimento di intere fette di ippocampo presentati in questo video. Vorremmo anche ringraziare Sarah Parrish per aver aiutato con il testo che accompagna il video.

PROTOCOLLO per la trasfezione BIOLISTIC Nella produzione di proiettili Proiettili sono buoni per un massimo di 6 mesi, ma potrebbe cominciare a diminuire in termini di efficienza di trasfezione dopo 2-3 mesi. Proiettili deve essere conservato a 4 ° C in presenza di pellet essiccante. Sempre lasciato le fiale di scintillazione, in cui sono memorizzati proiettili, a temperatura ambiente prima di aprire il flacone. Prima di iniziare sono pronti: <ul><li> Spermidina (0,05 m) </li><li> CaCl 2 (1M) </li><li> EtOH (100% di alta qualità, non aperto bottiglia) </li><li> Autoclavato H 2 0 </li><li> Di DNA da transfettate </li><li> Polivinilpirrolidone (PVP-20 mg / ml di brodo) </li><li> 2 x 15 ml coniche (2/bullet set) </li><li> Tubi (tagliato in 1 X ~ 30 pollici / set proiettile) </li><li> Fiale di scintillazione (set 1/bullet) </li><li> Essiccazione pellet </li><li> Siringa da 10 ml w / tubazioni alla fine </li></ul> Preparare tubi: <ol><li> Secco ~ 30 pollici di tubo (circa 2 pollici si estende oltre a destra O-ring) nella stazione di tubo w / N 2 gas (0,4 pressione) per un minimo di 20 min. </li></ol> Precipitare il DNA perline d&#39;oro: <ol><li> Preparare DNA da transfettate in 50 volumi μmL totale in provetta (massimo DNA 50 mg in totale) </li><li> Pesare 6-8 mg di oro e di trasferimento in un tubo da microcentrifuga </li><li> Aggiungere 100 ml di spermidina 0,05 m a oro e ultrasuoni per 20 secondi </li><li> Aggiungere i 50 ml di DNA per l&#39;oro / spermidine </li><li> Vortex (circa impostazione 5) w / cappello aperto </li><li> Aggiungere goccia a goccia 100 l di CaCl 2 1M </li><li> Sonicare brevemente (&lt;5 sec) </li><li> Lasciar decantare per 10 minuti a temperatura ambiente </li><li> Sonicare brevemente </li></ol> Preparare la soluzione PVP durante la sonicazione: <ol><li> Fai la soluzione diluita di PVP in 15 ml, 3,5 ml diluire PVP per ogni set di proiettili (aggiungere 7,5 l di magazzino 20mg/ml PVP al 3,5 ml di EtOH 100%) </li></ol> Risciacquo perline oro con EtOH: <ol><li> Spin down perle d&#39;oro alla massima velocità per 10 secondi in microcentrifuga </li><li> Gettare il surnatante, ma tenere una piccola quantità di liquido sulla parte superiore di perline oro </li><li> Lavare 3 volte con 1 ml di EtOH, ultrasuoni per un breve istante, se necessario </li></ol> Risospendere oro / DNA in soluzione PVP: <ol><li> Risospendere il pellet oro in 200 ml di ml 3,5 diluire PVP / EtOH soluzione </li><li> Vortex il pellet oro per sospendere di nuovo (brevemente sonicare se necessario) </li><li> Trasferire i 200 ml di oro / PVP soluzione ad un nuovo 15 ml conica </li><li> Continuare in questo modo, aggiungendo 200 ml di PVP alla volta fino a tutto l&#39;oro è stato trasferito il 15 ml conica, e il volume finale è di 3,2 ml </li></ol> Rivestimento tubi: <ol><li> Spegnere N 2 alla stazione di tubi e rimuovere tubi secca </li><li> Collegare il tubo secca alla siringa da 10 ml </li><li> Agitare vigorosamente i 15 ml conica riempita d&#39;oro / PVP </li><li> Posizionare l&#39;estremità del tubo in oro / soluzione di PVP e succhiare lentamente, facendo attenzione ad evitare le bolle </li><li> Lascia ~ 2 pollici a secco da entrambe le estremità del tubo </li><li> Con il tubo ancora attaccato alla siringa e riempite con la soluzione d&#39;oro / PVP, posizionare con attenzione il retro tubo nella stazione </li><li> Segnare le estremità del tubo in cui la soluzione si trova </li><li> Lasciate che l&#39;oro accontentarsi di 5 minuti con la siringa collegata </li><li> Succhiare-la soluzione molto lentamente tirando la siringa in modo che l&#39;oro si stabilirono è lasciato alle spalle (non sono sicuro di fare back-wash) </li><li> Staccare la siringa </li><li> Ruota di 90 ° e lasciate riposare 2 secondi </li><li> Ruotare di 180 ° e lasciate riposare altri 2 secondi </li><li> Ruotare la provetta per 5 sec </li><li> Accendere la N 2 in modo che la valvola si legge tra 0,4 - 0,5 e girare l&#39;oro rivestite tubi durante l&#39;asciugatura per 5 min. </li></ol> Taglio tubi: <ol><li> Rimuovere il tubo dal tubo preparazione-stazione e tagliare le estremità a marchi. </li><li> Metti una fiala di scintillazione etichettati con l&#39;elicottero tubi per prendere le cartucce taglio </li><li> Tubo posto nel tubo di chopper e tagliare il tubo con il rasoio pulito </li><li> Posizionare un pellet essiccazione in flaconcino scintillazione </li><li> Conservare le cartucce a 4 ° C </li></ol> Shooting fette di tessuto Quando si riprende fette colto, è importante utilizzare una tecnica relativamente sterile per evitare contaminazioni. Ricordate che quando si scatta due costrutti differenti, entrambe le serie di proiettili che possono essere caricati nel supporto della cartuccia stessa, ma la canna-liner e lo schermo dovrebbe essere cambiato tra i costrutti. Prima di iniziare sono pronti: <ul><li> Proiettili del DNA (per non fiala di scintillazione a temperatura ambiente prima di aprire) </li><li> Fette di tessuto </li><li> Helios Gun Gene </li><li> Serbatoio di elio con tubo gene pistola allegato &lt;/ Li&gt; <li> Cartuccia titolare </li><li> Botte con fodera in plastica O-ring in posizione </li><li> Diffusore (modificato) </li><li> Diffusore schermo </li><li> Forcipe </li></ul> Preparando la pistola gene: <ol><li> Forcipe utilizzando posto delle cartucce di plastica rivestiti in oro il supporto della cartuccia. </li><li> Posizionare il supporto della cartuccia nella pistola gene dapprima spingendo indietro blocco </li><li> Fissare il supporto della cartuccia con serratura </li><li> Ottenere un rivestimento a botte con un O-ring e lo schermo diffusore saldamente in posizione </li><li> Avvitare la canna-liner nella pistola gene </li></ol> Shooting fette di coltura con la pistola del gene: <ol><li> Indossare cuffie </li><li> Collegare la pistola gene in tubo collegato serbatoio del gas elio </li><li> Alzare la pressione sul serbatoio a 180 PSI </li><li> Spara un vuoto in aria al fine di rimuovere ogni traccia di polvere o detriti dallo schermo diffusore. Per sparare la pistola, prima premere il pulsante di blocco di sicurezza fino a quando il bip pistola, poi premere il grilletto. </li><li> Dopo lo scatto in bianco, togliere le fette dalla incubatore </li><li> Anticipo pistola a costruire prima </li><li> Spara con lo schermo diffusore di circa 0,5 - 1 pollice dalla fetta </li><li> Anticipo la cartuccia tra i pozzi. </li><li> Dopo aver sparato il bene ultimo, disporre le fette di nuovo nel incubatore </li><li> Spegnere la pressione del gas e rilasciare prima di staccare la pistola dal tubo di elio </li><li> Svitare il rivestimento barile, e rimuovere la cartuccia e le conchiglie utilizzate </li></ol> Pulizia titolari cartuccia e rivestimenti barile: <ol><li> Cartucce luogo, rivestimenti barile, e gli schermi diffusore in un bicchiere con acqua e sapone </li><li> Bicchiere posto in bagno sonicatore e ultrasuoni per 20 minuti </li><li> Sciacquare con acqua fino a quando tutti i residui di sapone vengono rimossi </li><li> Mettere a bagno in 70% EtOH per un&#39;ora </li><li> Mettere su carta assorbente per asciugare asciugare durante la notte </li><li> Pulire le cartucce, rivestimenti barile, e gli schermi possono essere riutilizzati nei successivi trasfezioni biolistic </li></ol> Riprese suggerimenti guai per Transfection Biolistic Trasfezione Biolistic a volte può risultare in condizioni non ottimali di trasfezione. Può portare a troppo pochi o troppo molte cellule transfettate, troppo alti o troppo bassi livelli di espressione, o può causare fette di tessuto a diventare generalmente malsano. Spesso il risultato malsano fette dall&#39;esplosione di pressione. Ecco alcuni consigli per ottenere fette di tessuto in modo ottimale transfettate. Se le fette sembrano essere malsana (o se troppe cellule sono transfettate / fetta), prova: <ul><li> all&#39;aumentare della distanza di tiro </li><li> diminuzione di pressione sul serbatoio del gas </li><li> diminuendo la quantità di oro </li><li> tagliare fuori il centro della Bio-Rad diffusore e sostituire il centro con uno schermo diffusore. </li></ul> Se le cellule sono troppo pochi transfettate, prova: <ul><li> diminuzione distanza di ripresa </li><li> crescente pressione sul serbatoio del gas </li><li> aumentare la quantità di oro </li><li> aumentando il numero di fette di tessuto / e </li><li> assicurarsi che l&#39;O-ring nella canna-liner è intatto. </li></ul> Se si ottengono fette con entrambe le celle troppi e troppo pochi transfettate durante le riprese stesse accertarsi che: <ul><li> che si sta tenendo la pistola simmetricamente sopra e </li><li> che l&#39;oro è uniforme rivestimento all&#39;interno del tubo. (Se hai trovato una linea d&#39;oro, tirare fuori il surnatante dal tubo ad una velocità maggiore una volta che l&#39;oro si è stabilito e ruotare l&#39;oro più a lungo prima di accendere l&#39;azoto. Se, invece, hai trovato striature d&#39;oro , questo è probabilmente dovuto all&#39;esposizione troppa umidità durante rendendo proiettile: assicurarsi che si sta utilizzando una bottiglia chiusa di EtOH, che il tubo sia completamente asciutto prima di rivestimento, e che si tappatura coperchi e la preparazione di proiettili in un modo attuale). </li></ul> Se l&#39;efficienza di trasfezione sembra ottimale (# cellule transfettate / fetta), ma il livello di espressione sembra troppo alta o troppo bassa: <ul><li> regolare il rapporto di DNA in oro. (Ad esempio, se è troppo basso mantenere la quantità di oro, ma aumentare la quantità di DNA.) </li><li> regolare la quantità di tempo tra le riprese e la raccolta dati </li></ul> Nel caso di transfezione doppio, se hai trovato espressione troppo poco di uno dei tuoi costrutti, regolare il rapporto tra i due costrutti in modo appropriato e fare in modo che entrambi i costrutti sono sotto il promotore stesso, in modo da assicurarsi che uno promotore non entrare in competizione l&#39;altro.

<ol><li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li>
<li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li>
<li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
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Transfezione Biolistic è un mezzo fisico di trasfezione delle cellule tramite bombardamento di tessuto vivente ad alta velocità con particelle d&#39;oro rivestiti di DNA. Nel trasferimento di geni mediato delle particelle, in genere cellule transfettate risultato quando il proiettile si ferma nel nucleo. Mentre molti metodi di trasfezione diverse esistono, come la microiniezione, lipofection, calcio-fosfato trasfezione, elettroporazione e trasfezione virale, trasfezione biolistic in grado di offrire un lavoro meno intenso, ed efficiente alternativa per trasfezione delle cellule che non sono facilmente transfettate con questi altri metodi. Infatti, è stato sviluppato come una tecnica di trasferimento genico nelle piante in quanto la presenza della parete cellulare reso difficile trasfezione con metodi preesistenti 1. Allo stesso modo, biolistics ha guadagnato popolarità nel campo della neurobiologia dall&#39;ultimo post-mitotico neuroni sono notoriamente difficili da 2,3 trasfezione. In particolare, è ampiamente riconosciuto come la tecnica del principio da utilizzare in esperimenti volti a valutare la morfologia multa di singoli neuroni in fettine di cervello intatto. I metodi descritti qui fornisce una spiegazione dettagliata e completa di come eseguire trasfezione biolistic di fette di cervello colto con una mano tesa gene-gun (Gun sistema Helios Gene; Bio-Rad). Trasfezione Biolistic è diventato il metodo preferito per la trasfezione neuroni in cultura fetta perché permette trasfezione di un certo numero di cellule sparse per tutta la fetta cervello. In questo modo, i singoli neuroni possono essere esaminate in modo isolato. Poiché questa tecnica è particolarmente adatto per trasfezione neuroni nel cervello fetta, è spesso utilizzato in combinazione con 2-fotone microscopia, dal momento che 2-fotone eccitazione permette la visualizzazione di cellule marcate in profondità all&#39;interno dei tessuti dispersione della luce 4. Infatti le immagini ad alto ingrandimento dei singoli neuroni piramidali presentato in tutto il video sono stati catturati usando un custom 2-fotone microscopio a scansione laser. In conclusione la transfezione biolistic è un mezzo efficace di trasfezione delle singole cellule nel contesto di una alta densità di cellule circostanti, e come tale si è dimostrato estremamente utile per l&#39;etichettatura fluorescente singoli neuroni in coltura fetta neuronale.

Anche se abbiamo elencato tutti i prodotti separatamente, è più economico per l&#39;acquisto di &quot;Helios Gene-Gun System&quot;, che include tutti i prodotti da Bio-Rad sopra elencati (cat # 165-2431).

preparazione di proiettili pistola gene e biolistic transfection dei neuroni in cultura slice

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Transfezione Biolistic è un mezzo fisico di trasfezione delle cellule dei tessuti bombardando con particelle ad alta velocità DNA rivestito. Forniamo un protocollo dettagliato per la trasfezione biolistic fettine di ippocampo di ratto, dalla preparazione iniziale dei proiettili rivestiti di DNA per le riprese finali delle culture fetta organotipica utilizzando una pistola genica. Pistola transfezione gene è un mezzo efficace e facile trasfezione di neuroni ed è particolarmente utile per l&#39;etichettatura fluorescente un piccolo sottoinsieme di cellule fetta del tessuto. In questo video, ci siamo delineare i passaggi necessari per rivestire le particelle d&#39;oro con il DNA. Siamo prossimi alla linea di dimostrare come l&#39;interno del tubo di plastica con i proiettili d&#39;oro / DNA, ed a tagliare questo tubo per ottenere le cartucce di plastica per il caricamento nella pistola gene. Infine, eseguiamo trasfezione biolistic di culture fetta dell&#39;ippocampo di ratto, dimostrando la gestione della Bio-Rad Helios pistola del gene, e offrendo consulenza riprese briga di ottenere fette di tessuto sano e ottimale transfettate.

Descriviamo un metodo per la preparazione di proiettili rivestiti d&#39;oro del DNA e dimostrare l&#39;uso di proiettili ad esempio per trasfettare biolistically neuroni in colture di fettine di ippocampo.

Preparazione di proiettili pistola Gene e Biolistic Transfection dei neuroni in cultura Slice

La trasfezione biolistica è un metodo fisico per trasfettare le cellule mediante il bombardamento di tessuti con particelle rivestite di DNA ad alta velocità. Forniamo un...

La trasfezione mediante gene gun o biolistica è un metodo fisico per trasfettare le cellule bombardando il tessuto con particelle rivestite di DNA ad alta velocità. Questa tecnica rappresenta un metodo efficiente e semplice per trasfettare i neuroni ed è particolarmente utile per trasfettare solo un piccolo numero di cellule in una sezione di tessuto. Ad esempio, nella microscopia fluorescente, studi volti a esaminare la morfologia neuronale in una sezione integra.La trasfezione con Bic facilita la visualizzazione di singoli neuroni in un fondo pulito di cellule non trasfettate. In questo video, dimostriamo un metodo per produrre proiettili per micropistola genica rivestiti di DNA e quindi eseguire la trasfezione con Bic su colture organotipiche di fette ippocampali. Ciao, sono Georgia Woods.Sono uno studente laureato nel laboratorio della dottoressa Karen Zito presso l'Università della California a Davis. Oggi dimostrerò come preparare proiettili rivestiti di DNA e come eseguire la trasfezione Bic su sezioni ippocampali di ratto. I passaggi fondamentali alla base della trasfezione Bic consistono nel rivestire innanzitutto le particelle d'oro con il DNA da trasfettare, quindi nel rivestire l'interno del tubo di plastica con quest'oro.Tagliare il tubo in cartucce da caricare nel gene gun e sparare quattro volte sul tessuto da trasfettare. Cominciamo dunque. Prima di essere pronti per la trasfezione, dobbiamo innanzitutto preparare le pallottole rivestite di DNA.Questo prevede il rivestimento di particelle d'oro di 1,6 micron con il plasmide di DNA da trasfettare. Durante lo sparo, una singola particella d'oro fungerà da proiettile che penetrerà nella cellula, portando alla trasfezione. Pertanto, per prima cosa, dobbiamo preparare il DNA da trasfettare.In linea di principio, si desidera utilizzare meno di 50 microgrammi di DNA per ogni serie di proiettili, in un volume totale di 50 microlitri di acqua. Tieni presente che la quantità esatta di DNA da utilizzare deve essere determinata empiricamente per ciascun costrutto, in base al livello ottimale di espressione da ottenere. Ora che abbiamo il nostro aliquota di DNA, dobbiamo aggiungere lo spermidina alle perline d'oro.Aggiungere agli otto mg di oro pre-pesati cento microlitri di sperma, meine e sottoporre a sonicazione. Circa 20 secondi. È sperma.La meina è un'ammina polivalente che conferisce una carica positiva all'oro, favorendo l'interazione con il DNA dotato di carica negativa grazie al metallo carico positivamente. Dopo il 22° figlio, aggiungere la soluzione acquosa di DNA da 50 microlitri all'oro. Una volta aggiunto il DNA alle perle, vortexare aggiungendo goccia a goccia cento microlitri di cloruro di calcio; il cloruro di calcio induce la precipitazione del DNA.Dopo una breve agitazione con vortex, lasciare precipitare la soluzione per 10 minuti. Dopo la precipitazione di 10 minuti, centrifugare il DNA e l'oro a velocità massima per 30 secondi in una centrifuga da banco; dopo la 32ª centrifugazione ad alta velocità, rimuovere con la pipetta la maggior parte del soprannatante, evitando di aspirare il pellet d'oro. A questo punto, sto semplicemente eliminando qualsiasi DNA che non si è precipitato sull'oro.Le particelle d'oro vengono quindi lavate in un millilitro di etanolo appena aperto e sottoposte a sonificazione brevemente. Una volta che il DNA precipita, tende a causare l'aggregazione dell'oro. Una leggera sonificazione rompe questi aggregati, ma bisogna fare attenzione a non spezzare il DNA con una sonificazione eccessiva.I pellet d'oro vengono centrifugati nuovamente e l'etanolo viene rimosso per pipettaggio. Ripetere il lavaggio con etanolo altre due volte. Dopo il terzo lavaggio con etanolo, aggiungere 200 microlitri della soluzione diluita di polivinilperonato o PVP e sottoporre a sonica.Trasferire brevemente l'oro rivestito in una provetta conica da 15 mil contenente già 200 microlitri di soluzione diluita di PVP. Il PVP è un solvente che provoca l'adesione delle particelle d'oro ai tubi di plastica utilizzati. Nel passaggio successivo, rimuovere le tracce di perline d'oro rimaste nella provetta eppendorf aggiungendo 200 microlitri di PVP nella provetta eppendorf.Quindi agitare brevemente e trasferire nel tubo conico da 15 ml. Ripetere fino a quando tutto l'oro è stato trasferito nel tubo conico da 15 ml. Trasferire la soluzione rimanente di PVP in modo che l'oro venga ora risospeso in una soluzione da 3,2 ml di PVP in etanolo.Ora siamo pronti a rivestire il tubo di plastica che verrà utilizzato per contenere i proiettili della pistola genica quando saranno inseriti nella pistola. Ora che l'oro è stato ricoperto di DNA, dobbiamo rivestire l'interno del tubo di plastica con le particelle d'oro. È questo tubo di plastica rivestito d'oro che verrà effettivamente caricato nel tubo della pistola genica.Iniziare, tagliare un pezzo di tubo in modo che si estenda di circa due pollici oltre l'O-ring. Una volta posizionato il tubo nella stazione di preparazione, ruotare la valvola di pressione in modo che il flussimetro indichi circa 0,4. L'azoto fornisce un'atmosfera priva di acqua per asciugare il tubo; asciugare il tubo per circa 20 minuti.È preferibile eseguire questo passaggio di essiccazione mentre si ricoprono le microparticelle d'oro con il DNA, come mostrato nel passaggio precedente. In questo modo, il tubo sarà asciutto e pronto per essere rivestito non appena avrete terminato. Preparare ora le perle d'oro, ora che il tubo è asciutto e che l'oro è stato ricoperto con il DNA.Spegnere la stazione N due prima di riempire il tubo con la soluzione di PVP-oro e rimuovere il tubo essiccato dalla stazione, quindi collegarlo alla siringa da 10 mil prima di aspirare il PVP e l'oro nel tubo. Agitare accuratamente la soluzione e aspirarla immediatamente nel tubo essiccato, evitando bolle d'aria. Inoltre, fare attenzione a non aspirare la soluzione all'interno della siringa.Ora che il tubo è riempito con la soluzione di oro PVP, posizionare con attenzione il tubo nuovamente nella stazione N due. Lasciare riposare la soluzione per cinque minuti con la siringa collegata, in modo che le particelle d'oro si depositino sul fondo del tubo. Contrassegnare le estremità del tubo nel punto in cui si deposita la soluzione.Dopo che la soluzione si è depositata, una striscia d'oro sarà visibile sul fondo del tubo utilizzando la siringa collegata. Rimuovere il soprannatante molto lentamente, assicurandosi di non causare un riflusso o disconnettere il tubo. Ora dobbiamo ruotare ed asciugare il tubo al fine di far aderire l'oro in modo uniforme su tutta la superficie interna del tubo.Per prima cosa, ruotare il tubo di 90 gradi. Attendere due secondi. Ora ruotare di altri 180 gradi e attendere altri due secondi.Ruotare per cinque secondi e quindi accendere l'N due in modo che lo strumento indichi un valore compreso tra 0,4 e 0,5, continuando a far girare mentre il tubo si asciuga per cinque minuti. Ora che sono trascorsi i cinque minuti e il nostro oro è asciutto, dobbiamo tagliare il tubo in cartucce che possano essere caricate nel gene gun. Ora taglierò il tubo in sezioni di circa mezzo pollice per ottenere le capsule di dimensioni adeguate da inserire nel cilindro del gene gun.Per raccogliere i gusci, posizionare la simulazione di bile sigillata sotto il taglierino, tagliare il tubo in corrispondenza dei segni e quindi tagliare il tubo con un rasoio pulito. Posizionare il tubo nel tritatore per tubi per ottenere una lunghezza adeguata. Basta far avanzare il tubo finché non si avverte una resistenza, quindi effettuare il taglio.Dopo aver tagliato il tubo e raccolto il campione nel vial per scintillazione, inserire un pellet disidratante nel vial. Le particelle sono utilizzabili fino a sei mesi, ma dopo due o tre mesi potrebbero iniziare a mostrare una riduzione dell'efficienza di trasfezione. Pertanto, è buona norma etichettare il vial con il nome del costrutto e la data.I proiettili possono essere utilizzati immediatamente dopo la preparazione oppure conservati a quattro gradi Celsius. Se si utilizzano proiettili conservati a quattro gradi Celsius, lasciare che la provetta si riscaldi a temperatura ambiente per circa 15 minuti prima di aprirla, per evitare che i proiettili assorbano umidità. Siamo ora pronti a sparare i proiettili di DNA utilizzando un gene gun.Ora che i proiettili sono pronti, sono pronto a trasfettare effettivamente le cellule. Utilizzerò un gene gun BioRad Helios e spararò su sezioni di ippocampo di ratto che sono state incubate per cinque giorni da quando sono state dissezionate. Il gene gun sarà collegato a una bombola di gas elio.Quando viene sparato il cannello, una breve raffica di pressione proveniente dalla bombola accelererà le particelle d'oro verso la sezione. In generale, quando una particella d'oro si inserisce nel nucleo della cellula, tale cellula diventa trasfettata.Dato che sto effettuando sezioni trasversali di fettine coltivate, utilizzo una tecnica relativamente sterile durante tutta la trasfezione con Bic per evitare contaminazioni. Una volta che le cartucce si sono riscaldate a temperatura ambiente, aprire la fiala di simulazione e inserire le cartucce di plastica rivestite d'oro nel portacartucce. Quindi posizionare il portacartucce nel cannone genico spingendo prima indietro il blocco del cilindro.Ora la guaina del barile deve essere fissata alla pistola. Innanzitutto, assicurarsi che l'anello O sia inserito nella guaina del barile e che lo schermo diffusore sia ben fissato. Lo schermo ha la funzione di distribuire la pressione proveniente dal barile e favorisce la dispersione dell'oro, consentendo una distribuzione più uniforme dell'oro nel pozzetto.Avvitare completamente il rivestimento del barile nel gene gun. Quando si utilizzano due costrutti diversi, entrambi i set di proiettili possono essere caricati nello stesso portacartucce, ma il rivestimento del barile e il filtro devono essere sostituiti tra un costrutto e l'altro. Il gene gun è ora pronto per essere collegato alla sorgente di elio.Collegare la pistola genica al tubo collegato alla bombola di gas elio. Deve agganciarsi al suo posto e aumentare la pressione sulla bombola fino a 180 PSI. La pistola è ora pronta per sparare, ma prima ricordarsi di indossare protezioni per le orecchie e, per rimuovere polvere o detriti dalla schermatura diffusore, sparare un colpo a vuoto.Prima, premere il pulsante di sicurezza fino a quando la pistola emette un segnale acustico ed estrarre il grilletto. Ora siamo pronti per sparare sulla sezione. Dopo aver sparato sul vuoto, rimuovere le sezioni dall'incubatrice.Durante le dissezioni dell'ippocampo, posizioniamo quattro sezioni per pozzetta e le disponiamo in modo da formare gli angoli di un quadrato di due centimetri di lato, vicino al centro della membrana. Illuminare ogni pozzetta con lo schermo diffusore a una distanza di circa mezzo pollice a un pollice dalla sezione. Le cellule trasfettate possono generalmente essere esaminate entro uno a cinque giorni, a seconda del costrutto.Dopo aver sparato in tutti i pozzetti, spegnere il gas e rilasciare la pressione prima di staccare la pistola dal tubo dell'elio. Rimuovere i cartucce e i bossoli usati. Smontare il rivestimento della canna; cartucce, rivestimenti della canna e schermi possono essere puliti immergendoli in una soluzione acquosa saponata e sottoponendoli a ultrasuoni per 20 minuti, quindi risciacquandoli accuratamente con acqua, immergendoli in etanolo al 70% per un'ora e infine ponendoli su un tovagliolo di carta asciutto per tutta la notte.I cartucce e i filtri puliti possono quindi essere riutilizzati nelle successive trasfezioni biotiche. Ora esaminiamo alcuni dei risultati ottenuti con la trasfezione. Anche per una preparazione standard di fette di ippocampo, l'efficienza di trasfezione può variare notevolmente a seconda dei proiettili e delle fette.Generalmente, è consigliabile una bassa efficienza di trasfezione al fine di ottenere neuroni trasfettati ben isolati. Inoltre, quando vengono trasfettate troppe cellule, la salute complessiva della sezione risulta compromessa anche nelle condizioni ottimali. Di solito si hanno meno di 20 cellule per sezione, ma spesso altre sezioni nello stesso pozzetto finiscono con un numero molto maggiore di cellule.Le fette trasfettate e le altre fette conterranno un numero inferiore di cellule. Le incongruenze nella trasfezione tra le diverse fette sono solitamente dovute al fatto che il posizionamento delle fette rispetto al cannello non era simmetrico, oppure che l'oro non era distribuito uniformemente lungo il tubo, ma concentrato su un solo lato. Se vengono trasfettate troppe cellule, provare ad aumentare la distanza di sparo rispetto al campione, oppure ridurre la pressione di sparo o la quantità di oro utilizzata per la preparazione dei proiettili.Qui potete osservare un ottimo esempio di un neurone parametale transfettato. In questa particolare cellula, possiamo vedere un proiettile d'oro incorporato nella cellula. Ecco un'immagine più ravvicinata di un neurone transfettato. In ca uno, a volte la sparatoria può portare a fette non sane.Spesso le sezioni risultano non sane a causa del getto di pressione. Il sistema di gene gun Helios è fornito con un diffusore che presenta una croce metallica al centro. Rimuoviamo la croce metallica interna e al suo posto utilizziamo una rete metallica.Tagliamo semplicemente la rete leggermente più grande rispetto all'estremità del rivestimento della canna e la stringiamo tra l'estremità del rivestimento della canna e il diffusore tagliato. Abbiamo riscontrato che questo migliora la salute delle sezioni. Inoltre, le condizioni ottimali di sparatura varieranno a seconda del preparato sperimentale; per ottimizzare diversi preparati sperimentali, variare la pressione del serbatoio di elio e la distanza di sparatura dal campione.Infine, nel caso in cui si desideri utilizzare proiettili con due costrutti diversi per una doppia trasfezione, assicurarsi che entrambi i costrutti siano posti sotto lo stesso promotore. In questo modo, un promotore non potrà sopraffare l'altro. Vi ho appena mostrato come preparare i proiettili per la pistola genica e come trasfettare fettine di ippocampo utilizzando la trasfezione BIC.Questo è un metodo estremamente potente per eseguire studi morfologici su singoli neuroni che possono essere immaginati in isolamento. È tutto. Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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