Name: Valutazione della deposizione di ferro nel cervello di topi 5xFAD mediante colorazione Perls/DAB (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T12:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Scopri la colorazione Perls/DAB per valutare la deposizione di ferro nel cervello di topi 5xFAD. Questo metodo permette di rilevare l'accumulo di ferro nell'ippocampo e nella corteccia con elevata sensibilità.

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<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-nitrosylation+of+divalent+metal+transporter+1+enhances+iron+uptake+to+mediate+loss+of+dopaminergic+neurons+and+motoric+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">S-nitrosylation of divalent metal transporter 1 enhances iron uptake to mediate loss of dopaminergic neurons and motoric deficit.</a> J Neurosci. 38 (39), 8364-8377 (2018).</li>
<li>Guillemot, J., Canuel, M., Essalmani, R., Prat, A., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+the+proprotein+convertases+in+iron+homeostasis%3A+Proprotein+convertase+7+sheds+human+transferrin+receptor+1+and+furin+activates+hepcidin%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Implication of the proprotein convertases in iron homeostasis: Proprotein convertase 7 sheds human transferrin receptor 1 and furin activates hepcidin.</a> Hepatology. 57 (6), 2514-2524 (2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+light+chain+interacts+with+pen-2+and+affects+%CE%B3-secretase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Ferritin light chain interacts with pen-2 and affects γ-secretase activity.</a> Neurosci Lett. 548, 90-94 (2013).</li>
<li>Jin Jung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+inactivation+of+protein+phosphatase+2a%2C+promoting+proinflammatory+nf-%CE%BAb+in+aged+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces inactivation of protein phosphatase 2a, promoting proinflammatory nf-κb in aged rat kidney.</a> Free Radic Biol Med. 61, 206-217 (2013).</li>
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Il morbo di Alzheimer (AD) è la malattia neurodegenerativa più comune ed è diventato un problema serio per la società. La prevalenza dell'AD aumenta notevolmente con l'età di 1,2,3,4 anni. I principali segni patologici della malattia di Alzheimer (AD) includono la deposizione di placche di β-amiloide (Aβ) e grovigli neurofibrillari (NFT) dovuti alla fosforilazione aberrante delle proteine tau. L'Aβ è generato attraverso la scissione sequenziale della proteina precursore dell'amiloide (APP) da parte degli enzimi β-secretasi e γ-secretasi. La disregolazione nella produzione o nella clearance di Aβ porta al suo accumulo nel cervello, formando placche amiloidi, che sono riconosciute come uno dei primi marcatori patologici dell'AD. Queste placche non solo causano danni neuronali diretti, ma avviano anche una cascata di effetti dannosi, tra cui neuroinfiammazione, stress ossidativo e disfunzione sinaptica. Collettivamente, questi processi contribuiscono alla morte neuronale e al progressivo declino cognitivo osservato nell'AD5. Nonostante decenni di ricerca mirati principalmente ai segni patologici della malattia di Alzheimer (AD), tra cui la deposizione di placche amiloide-β e l'aggregazione iperfosforilata della proteina tau, le scoperte terapeutiche clinicamente significative rimangono sfuggenti, con gli interventi esistenti che dimostrano un'efficacia limitata nel modificare la progressione della malattia6.
Il ferro è un metallo importante per il mantenimento della funzione cerebrale ed è coinvolto nel trasporto dell'ossigeno, nella sintesi del DNA, nella respirazione mitocondriale, nella sintesi della mielina, nella sintesi dei neurotrasmettitori e nel metabolismo. Tuttavia, il ferro diventa dannoso quando le concentrazioni superano la capacità di sequestro cellulare 6,7,8. Un aumento della deposizione di ferro, solitamente co-localizzato con placche di Aβ, è stato osservato sia nelle regioni corticali che in quelle ippocampali del cervello in pazienti con AD 9,10. Attraverso la reazione di Fenton11, il ferro libero intracellulare può generare radicali ossidrilici (•OH) e specie reattive dell'ossigeno. Queste sostanze nocive non solo inducono la neuroinfiammazione attivando le cellule gliali, ma attaccano anche le biomolecole della cellula attraverso lo stress ossidativo, interrompendo la normale funzione cellulare e portando alla disfunzione sinaptica 8,12. Inoltre, l'aumento del ferro è direttamente coinvolto nello sviluppo dei segni patologici dell'AD: il ferro contribuisce alla produzione di Aβ12 e aumenta anche la disfunzione della proteina tau, portando a grovigli neurofibrillari13.
Sono state sviluppate diverse tecniche per valutare il contenuto di ferro nel cervello, tra cui la risonanza magnetica per immagini (MRI), nonché metodi chimici e istochimici14. La quantificazione in vivo dei livelli di ferro intracerebrale mediante risonanza magnetica è clinicamente importante per i pazienti con invecchiamento e neurodegenerazione15. La risonanza magnetica ha il vantaggio di essere non invasiva e altamente sensibile: può rilevare la deposizione di ferro nelle prime fasi della malattia. In particolare, la tecnica dell'aumento dell'R2 campo-dipendente (FDRI) è in grado di distinguere tra diverse forme di ferro, come il ferro ferritina e il ferro eme16. Tuttavia, la risonanza magnetica non è in grado di rilevare l'accumulo di ferro a livello cellulare ed è costosa, quindi viene utilizzata principalmente nelle indagini cliniche17.
La misurazione colorimetrica è un metodo chimico che determina la concentrazione di una sostanza (come il ferro) misurando l'intensità del colore prodotto dalla reazione della sostanza in soluzione con un agente cromogenico18. Questo metodo è facile da eseguire e utilizza reagenti e strumentazione a basso costo, il che lo rende adatto a laboratori con budget limitati18. Tuttavia, l'accuratezza e la sensibilità di questo metodo sono molto limitate, poiché i risultati sono soggetti all'influenza di fattori ambientali, del tempo di sviluppo del colore e del giudizio soggettivo dell'operatore. La spettrometria di assorbimento atomico a fiamma (FAAS) è un altro metodo che può essere utilizzato per valutare i livelli di ferro19. In questo metodo, una soluzione campione chiarificata si ottiene bruciando il tessuto di interesse in un forno ad alta temperatura. Il campione viene quindi disciolto utilizzando acido cloridrico e la concentrazione di ferro nella soluzione viene determinata mediante spettrometria di assorbimento atomico. Questo metodo è altamente sensibile e adatto a tutti i tipi di campioni biologici19. Tuttavia, il processo richiede molto tempo e attrezzature costose, quindi il suo utilizzo è limitato.
La colorazione Perls/DAB per rilevare il ferro ferrico non eme è il metodo di rilevazione del ferro più comunemente usato a causa della sua elevata specificità e facilità di implementazione rispetto ad altri metodi istochimici14. A differenza dell'analisi colorimetrica, la colorazione di Perls è un metodo di colorazione istochimica qualitativa che si basa sulla reazione tra ioni ferro e ferrocianuro di potassio per generare un precipitato blu. Viene utilizzato per visualizzare al microscopio la presenza e la distribuzione del ferro nei tessuti. Inoltre, questo metodo ci permette di distinguere la deposizione di ferro in diversi tipi cellulari e di osservare la distribuzione subcellulare della deposizione di ferro, fornendo un metodo per lo studio del20 d.C. La colorazione di Perls rileva principalmente il ferro ferrico non eme e dipende dalla formazione del complesso blu di Prussia:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67501/67501eq01.jpg" style="margin: auto;">
(Blu di Prussia)
Tuttavia, la tradizionale colorazione di Perls è inefficace per rilevare la localizzazione del ferro a bassi livelli di ferro. Quando viene aggiunta la diaminobenzidina (DAB), reagisce con l'esacianoferrato ferrico per formare un composto marrone, aumentando la specificità del test21.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere come valutare la quantità e la distribuzione della deposizione di ferro nel cervello di un modello murino di AD. In questo protocollo, topi transgenici 5×FAD (C57BL/6J) di 8 mesi sono stati utilizzati come modello murino di AD e sono stati confrontati con topi wild-type della stessa età. I dettagli delle procedure per la preparazione del reagente chimico, il sezionamento del cervello, l'esecuzione della colorazione Perls/DAB e l'analisi delle immagini scattate dopo la colorazione sono presentati qui.

<table><tbody><tr><td>0,1 M PBS</td><td>biosharp</td><td>BL601A</td><td>Aggiungere acqua deionizzata per ottenere la soluzione</td></tr><tr><td>4% PFA&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>P0099</td><td>Ripristino a 4 gradi C per l'uso</td></tr><tr><td>20X soluzione DAB</td><td>Bioss</td><td>C-0003</td><td>Mix 10 &mu; l. soluzione A, 10 &mu; l soluzione B e 180 &mu; l PBS</td></tr><tr><td>Alcohol</td><td>Supelco</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>7647-01-0</td><td>Aggiungere acqua distillata a 50 ml</td></tr> di <tr><td>ketamina&nbsp;</td><td>China National Medicines</td><td>H20193336</td><td>100 mg/kg per anestetizzare</td></tr><tr><td>il microscopio</td><td>Olympus</td><td>CX43</td><td></td></tr><tr><td>Composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di ferrocinide di potassio</td><td>Sigma</td><td>14038-43-8</td><td>Aggiungere acqua distillata a 50 ml</td></tr> di <tr><td>saccarosio</td><td>Sigma</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>xilazina& nbsp;</td><td>Y-S Biotechnology</td><td>YS-(BC)-2842</td><td>15 mg/kg per anestetizzare</td></tr><tr><td>xileni Sigma</td><td></td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione della deposizione di ferro nel cervello di topi 5xfad mediante colorazione perls/dab

Assessing Iron Deposition in the Brains of 5xFAD Mice by Perls'/DAB Staining

Per studiare la distribuzione e l'accumulo di ferro in un modello murino di AD, abbiamo eseguito la colorazione Perls/DAB in fette sagittali di topi 5xFAD di 8 mesi. Come mostrato nella Figura 3, i segnali di colorazione di Perls/DAB sono stati osservati in topi 5xFAD e wild-type di 8 mesi e in topi wild-type di 2 mesi. Nei topi 5xFAD, sono stati osservati segnali di colorazione Perls/DAB elevati nell'ippocampo e nella corteccia, specialmente nel subiculum dell'ippocampo. I topi wild-type so...

Valutazione della deposizione di ferro nel cervello di topi 5xFAD mediante colorazione Perls/DAB

Alzheimer's disease (AD), a common neurodegenerative disease, is the leading cause of dementia in the elderly. Iron deposition is closely linked to the ...

assessing-iron-deposition-brains-5xfad-mice-perls-dab

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Una delle caratteristiche patologiche di Alzheimer è la formazione di placche di amiloide β neuritiche proteina positivo. In questo protocollo si descrivono due metodi per rilevare placche neuritiche in topi transgenici modello AD: rilevazione immunoistochimica utilizzando il metodo ABC e DAB e la rilevazione con metodo di colorazione fluorescente thioflavin S.

Rilevazione di placche neuritiche nel modello di malattia di Alzheimer mouse

Fonte: Mukherjee, K., et. al. Analisi dei mitocondri cerebrali utilizzando la microscopia elettronica a scansione seriale a scansione a blocchi. J. Vis. Exp. (2016)Questo video dimostra la preparazione,  imaging e analisi del tessuto cerebrale di topo utilizzando un microscopio elettronico a scansione seriale a blocchi (SBFSEM) per visualizzare l'ultrastruttura mitocondriale, consentendo una mappatura precisa della loro morfologia e distribuzione spaziale nei compartimenti neuronali assonali e...

 Imaging dei mitocondri neuronali utilizzando un microscopio elettronico a scansione seriale a scansione a blocchi

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Longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging del Cerebrovasculature: Rilevanza per le malattie del sistema nervoso centrale

Quantitativamente mappatura metalli in tessuto da ablazione laser - induttivo plasma ad accoppiamento - spettrometria di massa (LA-ICP-MS) è una tecnica analitica sensibile in grado di fornire nuovi indizi su come i metalli partecipare a normali processi di funzionamento e di malattia. Qui, descriviamo un protocollo per l'imaging quantitativo metalli in sezioni sottili di tessuto neurologico del mouse.

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In questo studio, presentiamo una procedura semplice ed efficace per valutare la rottura della barriera sangue - cervello sotto circostanze neurodegenerative. Per raggiungere il nostro obiettivo, abbiamo infuso isotiocianato di fluorescina di alto peso molecolare etichettato (FITC)-albumina in giugulare del mouse della vena e valutate le perdite nel parenchima cerebrale mediante microscopia a fluorescenza.

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Questo protocollo descrive un approccio efficiente e riproducibile per gli studi istologici sul cervello del topo, tra cui perfusione, sezionamento cerebrale, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging.

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Questo articolo dimostra come preparare e somministrare ferro isotopico non radioattivo legato alla transferrina per studi sul trasporto del ferro nella gravidanza del topo. Viene anche descritto l'approccio per quantificare il ferro isotopico nei compartimenti fetoplacentari.

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Qui viene fornito un protocollo per la misurazione del contenuto di ferro non eme nei tessuti animali, utilizzando un test colorimetrico semplice e consolidato che può essere facilmente implementato nella maggior parte dei laboratori.

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Il presente protocollo descrive e confronta la procedura per eseguire un'analisi a regione o sottoregione di interesse di sezioni cerebrali di topo sagittale per quantificare il carico di amiloide-beta nel modello murino transgenico APP / PS1 della malattia di Alzheimer.

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Il parto pretermine (parto &lt; 37 settimane) è un problema urgente di salute globale con opzioni di prevenzione e trattamento non ottimali. Presentiamo un modello murino di parto pretermine indotto da infezione batterica vaginale ascendente e delineiamo come analizzare la morbilità e la mortalità neonatale risultanti.

Modellazione dell'infezione vaginale ascendente, della nascita pretermine e della morbilità neonatale nei topi

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Valutazione della deposizione di ferro nel cervello di topi 5xFAD mediante colorazione Perls/DAB

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