Name: Ottimizzazione della reazione di trascrizione in vitro per la produzione di mRNA mediante monitoraggio cromatografico in linea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Scopri un metodo cromatografico rapido per ottimizzare la trascrizione in vitro dell'mRNA, monitorando in tempo reale il consumo di NTP e la produzione. Questa tecnica migliora la resa fino a 25 grammi per litro e riduce i costi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nat Biotechnol. 40, 840-854 (2022).</li>
<li>Baden, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+the+mRNA-1273+SARS-CoV-2+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine.</a> N Engl J Med. 384 (5), 403(2021).</li>
<li>Lopez Bernal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+Covid-19+Vaccines+against+the+B.1.617.2+%28Delta%29+Variant%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of Covid-19 Vaccines against the B.1.617.2 (Delta) Variant.</a> N Engl J Med. 385 (7), 585-594 (2021).</li>
<li>Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-based+therapeutics+-+developing+a+new+class+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">mRNA-based therapeutics - developing a new class of drugs.</a> Nat Rev Drug Discov. 13, 759-780 (2014).</li>
<li>Baptista, B. R., Carapito, N., Pichon, C., Sousa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA%2C+a+revolution+in+Biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">mRNA, a revolution in Biomedicine.</a> Pharmaceutics. 13, 2090(2021).</li>
<li>Rosa, S. S., Prazeres, D. M. F., Azevedo, A. M., Marques, M. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+vaccines+manufacturing%3A+Challenges+and+bottlenecks%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">mRNA vaccines manufacturing: Challenges and bottlenecks.</a> Vaccine. 39, 2190(2021).</li>
<li>Whitley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mRNA+manufacturing+for+vaccines+and+therapeutics%3A+mRNA+platform+requirements+and+development+of+a+scalable+production+process+to+support+early+phase+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Res%22%5BJournal%5D)">Development of mRNA manufacturing for vaccines and therapeutics: mRNA platform requirements and development of a scalable production process to support early phase clinical trials.</a> Transl. Res. 242, 38-55 (2022).</li>
<li>Kis, Z., Kontoravdi, C., Shattock, R., Shah, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resources%2C+production+scales+and+time+required+for+producing+RNA+vaccines+for+the+global+pandemic+demand%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Resources, production scales and time required for producing RNA vaccines for the global pandemic demand.</a> Vaccines. 9 (1), 3(2021).</li>
<li>Hengelbrock, A., Schmidt, A., Helgers, H., Vetter, F. L., Strube, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+mRNA+machine+for+regulatory+approval+of+variable+scale+between+1000+clinical+doses+to+10+million+manufacturing+scale+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Processes%22%5BJournal%5D)">Scalable mRNA machine for regulatory approval of variable scale between 1000 clinical doses to 10 million manufacturing scale doses.</a> Processes. 11, 745(2023).</li>
<li>Rosa, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mRNA+vaccine+production+with+Bayesian+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Maximizing mRNA vaccine production with Bayesian optimization.</a> Biotechnol Bioeng. 119 (11), 3127-3139 (2022).</li>
<li>Sari, Y., Sousa, S. S., Jeffries, J., Marques, M. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+T7+promoter+for+enhanced+yield+and+quality+in+mRNA+production%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of T7 promoter for enhanced yield and quality in mRNA production.</a> Sci Rep. 14, 9655(2024).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA+vaccine+development+landscape+for+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The mRNA vaccine development landscape for infectious diseases.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 333-334 (2022).</li>
<li>Pregeljc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+yield+of+in+vitro+transcription+reaction+with+at-line+high+pressure+liquid+chromatography+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Increasing yield of in vitro transcription reaction with at-line high pressure liquid chromatography monitoring.</a> Biotechnol Bioeng. 120 (3), 737-747 (2023).</li>
<li>Kern, J. A., Davis, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+fed-batch+system+to+produce+RNA+by+in+vitro+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Application of a fed-batch system to produce RNA by in vitro transcription.</a> Biotechnol Prog. 15 (2), 174-184 (1999).</li>
<li>Skok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-Scale+mRNA+Production+Using+a+250-mL+Single-Use+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Chemie+Ingenieur+Technik%22%5BJournal%5D)">Gram-Scale mRNA Production Using a 250-mL Single-Use Bioreactor.</a> Chemie Ingenieur Technik. 94 (12), 1928-1935 (2022).</li>
<li>Welbourne, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion+exchange+HPLC+monitoring+of+mRNA+in+vitro+transcription+reactions+to+support+mRNA+manufacturing+process+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Anion exchange HPLC monitoring of mRNA in vitro transcription reactions to support mRNA manufacturing process development.</a> Front Mol Biosci. 11, 1250833(2024).</li>
<li>Lee, K. H., Song, J., Kim, S., Han, S. R., Lee, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+strategies+for+optimization+of+in+vitro+transcription+and+quality+control+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring strategies for optimization of in vitro transcription and quality control of RNA.</a> Front Mol Biosci. 10, 1229246(2023).</li>
<li>Matuszczyk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+provides+valuable+process+insights+for+cell-derived+and+cellular+products%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy provides valuable process insights for cell-derived and cellular products.</a> Curr Opin Biotechnol. 81, 102937(2023).</li>
<li>Mu, X., Hur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+in+vitro-transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of in vitro-transcribed RNA.</a> Acc Chem Res. 54 (21), 4012-4023 (2021).</li>
<li>Cho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+silica+particle+as+an+RNA+adsorbent+for+facile+purification+of+in+vitro-transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mesoporous silica particle as an RNA adsorbent for facile purification of in vitro-transcribed RNA.</a> Int J Mol Sci. 24 (15), 12408(2023).</li>
<li>Ziegenhals, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dsRNA+by-products+during+in+vitro+transcription+can+be+reduced+by+using+low+steady-state+levels+of+UTP%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Formation of dsRNA by-products during in vitro transcription can be reduced by using low steady-state levels of UTP.</a> Front Mol Biosci. 10, 1291045(2023).</li>
<li>Höfer, K., Langejürgen, L. V., Jäschke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+aptamer-based+real-time+monitoring+of+enzymatic+RNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Universal aptamer-based real-time monitoring of enzymatic RNA synthesis.</a> J Am Chem Soc. 135 (37), 13692-13694 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m Filtro a membrana in PES, ad es. Sartolab BT 500</td><td>Sartorius</td><td>180E14---------E</td><td></td></tr><tr><td>Provette di plastica da 0,5 mL; ad es. DNA LoBind, PCR clean</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td></td></tr><tr><td>provette di plastica da 1,5 mL; ad es. DNA LoBind, PCR clean</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>ATP Solution</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R1331T2</tr><tr><td>Raffreddatore da banco -20 &deg; Colonna</td><td></td><td></td> analitica CIMac PrimaS da 0,1 mL 114935 <td></td></tr><tr><td>marca C (2 &micro; m)</td><td>Sartorius BIA Separazioni</td><td>110.5118-2, 2 &micro; m canali</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione CTP</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R3331T2</tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na2 x 2H2O</td><td>Kemika&nbsp;</td><td>ad es. 11368 08</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione GTP</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R2331T2</tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>1.10110.1000</td><td></td></tr><tr><td>Fiala HPLC ad alto recupero</td><td>Macherey-Nagel</td><td>702860</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>AM 9530G</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro per microvolumi</td><td>Thermo Scientic</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>mRNA standard, mFix4, 4000 nt</td><td>Separazioni Sartorius BIA</td><td>BIA-mFix4.1.1</td><td></td></tr><tr><td>Na4P2O7 + 10 H2O</td><td>Sigma</td><td>S6422-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fluka</td><td>31434-1KG-M</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1064691000</td><td></td></tr><tr><td>PATfix mRNA piattaforma analitica.</td><td>Sartorius BIA Separazioni</td><td>PAT0021</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta 100 &ndash; 1000 &u; L</td><td>Eppendorf</td><td>Reference 2</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta 2 &ndash; 10 &ndash; L</td><td>Eppendorf</td><td>Reference 2</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta 20 &ndash; 200 &u; L</td><td>Eppendorf</td><td>Riferimento 2</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfatasi</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td>M2403L</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Away Reagente di decontaminazione</td><td>Thermo Scientic</td><td>10328011</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore dell'RNAsi</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>RNK3501</tr><tr><td>Spermidina</td><td>Sigma</td><td>85558-5G</td><td></td></tr><tr><td>T7 mRNA polimerasi</td><td>MEBEP BIOSCIENCE</td><td>TR01</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock</td><td>Thermo Scientic</td><td>EPPE5382000.015</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T6066-1KG</td><td></td></tr><tr><td>UTP Soluzione</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R5331T2</tr><tr><td>Tappi per fiale</td><td>Macherey-Nagel</td><td>70245</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>IKA</td><td>V1900</td><td></td></tr></tbody></table>

ottimizzazione della reazione di trascrizione in vitro per la produzione di mrna mediante monitoraggio cromatografico in linea

Optimization of In vitro Transcription Reaction for mRNA Production Using Chromatographic At-Line Monitoring

L'analisi cromatografica descritta in questo protocollo può essere utilizzata sia per l'ottimizzazione dell'IVT che per convertire una reazione IVT batch in una reazione fed-batch (Figura 1).
Per testare l'effetto di diverse composizioni di tampone sulla cinetica della reazione IVT, sono state miscelate tre diverse reazioni IVT secondo il protocollo scritto nella Tabella 2. Il tampone contenente Tris, in cui il pH è stato regolato con HCl, è stato confrontato con il tampone Tris, in cui il pH è stato regolato con acido acetico. Inoltre, entrambi i tamponi Tris sono stati confrontati con il tampone HEPES, dove il pH è stato regolato con NaOH. La composizione di tutti i tamponi IVT 1x era di 40 mM Tris/HEPES, 10 mM DTT, 2 mM di spermidina e pH 7,9.
Da 100 μL di miscela di reazioni IVT, 2 μL di campione IVT sono stati prelevati dalla reazione IVT e temprati con 2 μL di EDTA 100 mM ogni 15 minuti nella prima ora di incubazione e poi ogni 30 minuti fino a 180 minuti di incubazione. La resa finale di mRNA prevista per questa condizione di reazione era di 15 mg/mL, il che significa che la diluizione di 2 volte dovuta al quenching è stata seguita da una diluizione di 400 volte in MPA+NaCl per l'analisi. Il campione è stato diluito 800 volte in totale, il che significa che anche alla produzione di 15 mg/mL, la concentrazione di mRNA caricata sulla colonna cromatografica analitica era ancora all'interno delle concentrazioni della curva di calibrazione.
Le aree NTP e mRNA ad A260 sono state integrate per ogni singolo campione in ogni singolo punto temporale (tx). Le aree sono state quindi convertite in concentrazioni per l'mRNA, utilizzando la curva di calibrazione dell'mRNA e la percentuale di consumo per gli NTP, utilizzando l'area A260 degli NTP a 0 min (t0) come 100% (vedi equazione sotto).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67503/67503eq01.jpg" style="margin: auto;">
I risultati possono essere mostrati come grafici per ogni singola reazione IVT, dove il tempo è mostrato sull'asse x e la concentrazione di mRNA e gli NTP rimanenti sono mostrati sull'asse y (Figura 2A). Tutte le IVT, ovvero le concentrazioni di mRNA in funzione del tempo, possono anche essere tracciate insieme in un unico grafico e possono essere studiate le cinetiche di produzione dell'mRNA e selezionate le condizioni ottimali di IVT (Figura 2B).
Per l'esperimento fed-batch, l'IVT è stato miscelato come scritto nella Tabella 3. Da 300 μl di miscela di reazione IVT, 2 μl di campione IVT sono stati rimossi dalla reazione IVT e temprati con 2 μl di 100 mM EDTA ogni 30 minuti. Inoltre, il campione è stato prelevato immediatamente dopo ogni aggiunta di NTP+MgCl2 . Una soluzione di alimentazione contenente 42,4 mM di ciascun NTP e 152,5 mM di MgCl2 è stata preparata in anticipo e 106 μL di ogni singolo 200 mM NTP sono stati miscelati con 76,2 μL di 1 M MgCl2. È stato stabilito un regime di alimentazione, in cui il mangime in bolo è stato aggiunto ogni ora (a 60 minuti, 120 minuti, 180 minuti e 240 minuti di incubazione). Il regime di alimentazione è descritto nella Tabella 3 I campioni sono stati analizzati quasi in tempo reale con analisi come descritto per la reazione IVT di massa. Dopo 300 minuti di monitoraggio, la reazione IVT è stata estinta.
I risultati possono essere mostrati come produzione residua di NTP/mRNA nel tempo di incubazione. Poiché le aggiunte di mangime in bolo diluiscono anche la reazione IVT, la concentrazione di mRNA nell'IVT diminuisce ad ogni aggiunta di mangime (Figura 3A). L'aumento della massa dell'mRNA può anche essere misurato e presentato da fattori di trascrizione (definiti comem mRNA/m pDNA), mostrando un aumento lineare della produzione di mRNA nel tempo (Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig01.jpg"> 
Figura 1: Panoramica schematica (A) Rappresentazione del flusso di lavoro di ottimizzazione IVT con quantificazione dell'analisi cromatografica in linea di NTP e mRNA. (B) Cromatogrammi rappresentativi di una reazione IVT batch campionata a (i) t0, (ii) punto medio, (iii) punti temporali di reazione finale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig02.jpg"> 
Figura 2: Grafici IVT in batch. (A) Grafico rappresentativo della reazione IVT con la produzione di mRNA e il consumo di NTP sull'asse y. Plateau di concentrazione di mRNA visibile a 120 - 180 minuti di incubazione, correlato al consumo di NTP poiché l'NTP limitante (ATP) viene consumato a 120 minuti. (B) Grafico IVT che mostra l'influenza del tampone IVT sulla cinetica IVT. L'IVT contenente il tampone A (Tris+acido acetico) ha mostrato la produzione di mRNA più veloce, seguita dal tampone B (Tris+HCl) e dal tampone C (HEPES+NaOH) come il più lento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig03.jpg"> 
Figura 3: Grafico IVT Fed-batch. (A) Grafico IVT in cui sono stati aggiunti mangimi NTP+MgCl2 a 60, 120, 180 e 240 minuti. La concentrazione di mRNA nella reazione IVT diminuisce ad ogni aggiunta di mangime a causa della diluizione con il mangime NTP+MgCl2 . (B) L'aumento della massa dell'mRNA mostrato dal fattore di trascrizione è lineare durante l'incubazione della reazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Protocollo IVT generico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Protocollo IVT batch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%202_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 3: Protocollo IVT Fed-batch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%203_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Ottimizzazione della reazione di trascrizione in vitro per la produzione di mRNA mediante monitoraggio cromatografico in linea

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA ...

optimization-vitro-transcription-reaction-for-mrna-production-using

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Questo protocollo descrive la preparazione di un substrato sintetico per il...

Test in vitro Metilazione tRNA con l&#39;Entamoeba histolytica del DNA e Dnmt2 tRNA metiltransferasi (Ehmeth) Enzyme

Qui descrivere un ottimizzato trascrittasi inversa multiplex PCR quantitativa (QRT-PCR) protocollo in combinazione con una piattaforma microfluidica come un efficace costi e tempi high-throughput screening per microRNA (miRNA) livelli di espressione, soprattutto quando si lavora con quantità limitate di campione.

Alta MicroRNA profiling Throughput: Multiplex Ottimizzato qRT-PCR a scala nanoliter sul Fluidigm dinamica IFCS ArrayTM

Descriviamo un metodo robusto per immunoprecipitazione della cromatina utilizzando cellule T primarie. Il metodo si basa su approcci standard, ma utilizza uno specifico insieme di condizioni e reagenti che migliorano l'efficienza per una limitata quantità di cellule. Importante, una descrizione dettagliata della fase di analisi dei dati è presentato.

Efficiente immunoprecipitazione della cromatina utilizzando Limitare quantità di biomassa

Qui vi presentiamo un protocollo per analizzare le interazioni RNA / proteine. Il saggio spostamento mobilità elettroforetica (EMSA) si basa sulla migrazione differenziale di complessi RNA / proteine ​​e RNA libero durante elettroforesi su gel nativo. Utilizzando una sonda RNA radioattivo, RNA complessi / proteici possono essere visualizzati mediante autoradiografia.

Electrophoretic Maiusc Mobility Assay (EMSA) per lo studio delle interazioni RNA-proteina: La IRE / IRP Esempio

Gallio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole e il suo analogo freebase presentano bassa citotossicità cellulare micromolare. Questo manoscritto descrive una reazione di trascrizione di RNA, RNA di imaging con un gel bromuro di etidio macchiate e quantificare RNA con spettroscopia UV-Vis, al fine di valutare l'inibizione della trascrizione da corroles e dimostra un metodo semplice di valutare le proprietà anticancro candidati.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzimatica Assay misurare Trascrizione inibizione da gallio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

In questo lavoro forniamo un flusso di lavoro sperimentale su come i potenziatori attivi possono essere identificati e convalidati sperimentalmente.

Previsione e Validazione del gene regolatore elementi attivato durante retinoico Acid Induced embrionali cellule staminali Differenziazione

Questo protocollo fornisce ai ricercatori con un nuovo strumento per monitorare la fedeltà della trascrizione in molteplici organismi di modello.

Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti

Il cross-linking cinetico e l'analisi del cDNA è un metodo che consente di studiare la dinamica delle interazioni proteina-RNA nelle cellule viventi ad alta risoluzione temporale. Qui il protocollo è descritto in dettaglio, compresa la crescita delle cellule di lievito, la reticolazione UV, la raccolta, la purificazione delle proteine e le fasi di preparazione della libreria di sequenziamento di prossima generazione.

Monitoraggio delle dinamiche di interazione proteina-RNA in vivo ad alta risoluzione temporale utilizzando χCRAC

Abbiamo sviluppato un saggio reporter di biogenesi di microRNA intronico da utilizzare in cellule in vitro con quattro plasmidi: uno con miRNA intronico, uno con il bersaglio, uno per sovraesprimere una proteina regolatrice e uno per Renilla luciferasi. Il miRNA è stato elaborato e potrebbe controllare l'espressione della luciferasi legandosi alla sequenza bersaglio.

Un saggio reporter per analizzare la maturazione dei microRNA intronici in cellule di mammifero

Qui, presentiamo un protocollo per la selezione in vitro di repressori trascrizionali ingegnerizzati (ETR) con un'efficienza di silenziamento alta, a lungo termine, stabile, on-target e bassa attività a livello di genoma, off-target. Questo flusso di lavoro consente di ridurre un repertorio iniziale e complesso di ETR candidati a un breve elenco, adatto per un'ulteriore valutazione in contesti terapeuticamente rilevanti.

In vitro Selezione di repressori trascrizionali ingegnerizzati per il silenziamento epigenetico mirato

Questo protocollo misura quantitativamente la stabilità e l'emivita degli RNA potenziatori intergenici e intragenici nelle cellule staminali embrionali di topo utilizzando il trattamento con Actinomicina D, RT-qPCR e analisi di regressione non lineare. Strategie di normalizzazione specifiche per posizione sono incorporate per modellare accuratamente la dinamica del decadimento dell'eRNA in modo dipendente dal contesto.

Valutazione Quantitativa Ottimizzata della Stabilità dell'RNA Potenziatore nelle Cellule Staminali Embrionali di Topo

Scopri un metodo cromatografico rapido per ottimizzare la trascrizione in vitro dell'mRNA, monitorando in tempo reale il consumo di NTP e la produzione. Questa tecnica migliora la resa fino a 25 grammi per litro e riduce i costi.

Ottimizzazione della reazione di trascrizione in vitro per la produzione di mRNA mediante monitoraggio cromatografico in linea

Esplora altri video