Valutazione dei geni correlati alla crescita anormale di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche combinando la tecnologia CRISPR/Cas9 con il conteggio delle cellule

Lo scopo della ricerca è la patogenesi della leucemia. Il nostro obiettivo è quello di identificare i geni critici per la proliferazione anomala delle HSPC combinandoli con CRISPR/Cas9 con i saggi CCK-8, rivelando il loro ruolo nella tumoregenesi e il potenziale come bersagli farmacologici.

L'editing genetico basato su CRISPR/Cas-9 fornisce un approccio semplice ed efficiente per ottenere il knockout genico nelle cellule eucariotiche. L'attuale sfida sperimentale è quella di aumentare ulteriormente l'efficienza del knockout CRISPR/Cas-9.

Il nostro protocollo utilizza topi Cas-9 per fornire alle cellule del midollo osseo l'espressione consultiva di Cas-9, quindi la consegna virale di SGI nelle cellule, migliorando così notevolmente l'efficienza sperimentale.

[Presentatore] Per iniziare, ottenere il femore e la tibia dal topo sperimentale eutanasia. Trasferire il femore e la tibia in una cappa a flusso laminare subito dopo la rimozione per mantenere la sterilità. Utilizzando una siringa sterile da un millilitro, lavare la cavità del midollo osseo con PBS contenente il 2% di FBS per raccogliere le cellule del midollo osseo. Pipettare le cellule del midollo osseo su e giù da 30 a 50 volte per disperderle in singole cellule. Trasferire la miscela di celle in una provetta da 50 millilitri e agitare per mescolare bene. Aggiungere 10 microlitri di sospensione cellulare a 40 microlitri di tampone di lisi eritrocitaria e metterlo su ghiaccio per cinque minuti per lisare gli eritrociti. Quindi aggiungere 50 microlitri di soluzione di Trypan blue. Mescolare bene e contare le cellule vitali. Quindi, centrifugare le cellule a 800 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il surnatante. Quindi risospendere le cellule a una concentrazione di una o due volte 10 alla potenza di sei cellule per millilitro nel midollo osseo, terreno di pre-stimolazione. E semina 10 millilitri di sospensione in un piatto da 10 centimetri. Incubare il piatto per 24 ore a 37 gradi Celsius. Per raccogliere le cellule pre-stimolate il giorno successivo, aggiungere da cinque a 10 millilitri di PBS contenente il 2% di FBS e risciacquare energicamente la piastra. Trasferire le cellule in una nuova provetta e aggiungere il blu di tripano alle cellule. Contare le cellule vitali nella miscela. Successivamente, centrifugare le celle a 800 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il surnatante, sospendete nuovamente le cellule in una soluzione di infezione appena preparata a una concentrazione di circa 10 alla potenza di sei cellule per millilitro. Seminare quattro millilitri di sospensione in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Sigillare la piastra con parafilm e centrifugarla a 1.500 G per 90 minuti a 32 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, risospendere delicatamente le cellule con una pipetta senza cambiare il terreno. Incubare la piastra per quattro-sei ore. Per la prima trasfezione, aspirare circa tre millilitri di terreno surnatante da ciascun pozzetto in un tubo e aggiungere un volume uguale di terreno di pre-stimolazione del midollo osseo. Se le cellule vengono aspirate accidentalmente, ripetere le fasi di centrifugazione e risospensione come descritto in precedenza. Per la trasfezione secondaria, il giorno successivo, rimuovere da due a tre millilitri di terreno da ciascun pozzetto e aggiungere un volume uguale di soluzione madre retrovirale appena scongelata insieme a quantità appropriate di hepas e polygreen. Centrifugare la piastra a 1.500 G per 90 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, risospendere delicatamente le cellule e continuare l'incubazione per quattro-sei ore. Ora, sostituisci il terreno come descritto in precedenza e incuba per 24 ore. Lavare la piastra con PBS contenente il 2% di FBS e raccogliere le cellule. Filtrare le cellule attraverso un setaccio da 70 micrometri prima di contare le cellule vitali utilizzando il blu di tripano. Successivamente, centrifugare le celle a 800 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in DMEM contenenti il 10% di FBS e interleuchina-3 murina, interleuchina-6 e fattore di cellule staminali. Centrifugare circa 0,5-1x10 alla potenza di sei celle a 800 G per cinque minuti ed eliminare il surnatante. Conservare il pellet cellulare a -80 gradi Celsius per l'estrazione del DNA genomico. Ora, aggiungi 1x10 alla potenza di quattro celle per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti, ottenendo sei pozzetti di replica per gruppo. Quindi aggiungere 100 microlitri di PBS sterile ai pozzetti circostanti e incubare fino a diversi punti temporali di 0, 24, 48 e 72 ore. Aspirare il terreno in ogni momento e aggiungere 110 microlitri di terreno contenente 1/10 del volume di soluzione di CCK-8 ai pozzetti. Incubare la miscela per un'ora. Infine, misurare l'assorbanza a 450 nanometri utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre. Il knockout di Trp53 ha aumentato significativamente la capacità proliferativa delle cellule staminali e progenitrici di topo, ematopoietiche rispetto ai controlli a 24, 48 e 72 ore, come misurato dal test CCK-8. L'efficienza di editing del Trp53 è stata stimata al 7,3% utilizzando l'analisi delle maree. E il sequenziamento di nuova generazione ha rivelato mutazioni che si verificano in diverse posizioni del gene.