Dispositivo di stretching equibiassiale per microscopia a fluorescenza confocale a cellule vive ad alto ingrandimento

Studiamo come le cellule rispondono e si adattano agli stimoli meccanici in contesti fisiologici e patologici. Per questo, utilizziamo il dispositivo di allungamento per applicare forze esterne, in questo caso una deformazione, alle cellule.

Abbiamo scoperto come le cellule e i tessuti cellulari reagiscono a specifici stimoli meccanici e come rispondono meccanicamente ad altri segnali biologici.

Il nostro dispositivo di stretching è molto versatile rispetto ad altri in quanto offre la possibilità di allungare cellule coltivate su gel di poliacrilammide di diverse rigidità o di eseguire esperimenti di compressione.

[Narratore] Per iniziare, posiziona gli anelli in PMMA su un foglio di carta da banco bianco. Passare con cautela intorno al bordo della piastra rivestita con PDMS utilizzando una lama per garantire un taglio netto lungo l'intera circonferenza. Usa una pinzetta per sollevare la membrana da un bordo, quindi sbucciala delicatamente con il pollice per staccare uniformemente metà della membrana dalla piastra. Usa le dita per distribuire uniformemente l'etanolo al 96% su tutta la superficie superiore dell'anello in PMMA. Rimuovere con cautela la membrana PDMS dalla piastra sollevandola dal bordo precedentemente sollevato. Quindi, posizionarlo simmetricamente sull'anello in PMMA ricoperto di etanolo, assicurandosi che non si formino pieghe ed evitando lo stiramento. Quindi, prendi un altro anello in PMMA vuoto e posizionalo sopra l'anello di montaggio. Utilizzare clip metalliche per sigillarli insieme, inserendo la membrana PDMS tra i due anelli. Posizionare la metà inferiore dell'anello elastico sul supporto di montaggio. Posizionare l'anello PDMS inserito nell'anello elastico e spingerlo con decisione verso il basso fino a quando non è completamente posizionato, assicurandosi che la guarnizione sia posizionata correttamente. Posizionare i pesi circolari in ottone sopra il campione. Quindi, posizionare la metà superiore dell'anello elastico in metallo sulla parte superiore, allineando i fori delle viti. Inserire tutte le viti e serrarle. Tagliare delicatamente il PDMS attorno all'anello utilizzando una lama. Coprire il gruppo con una capsula di Petri per proteggere la membrana dalla polvere. Preparare una diluizione di 250.000 di microsfere fluorescenti da 0,2 micrometri in PBS utilizzando la diluizione seriale. E posizionare una goccia da 10 a 30 microlitri della soluzione di perline al centro del PDMS. Lasciarlo asciugare a una temperatura non superiore a 40 gradi Celsius per evitare problemi di confusione post-polimerizzazione. A questo punto, montare il dispositivo di allungamento sul supporto del tavolino del microscopio e fissare il perno di allungamento sul microscopio. Applicare generosamente il lubrificante sull'area circolare del palo. Montare l'anello elastico preparato sul perno di allungamento e avvitare il tappo superiore per sigillare il gruppo. Quindi, collegare la parte posteriore della scatola di controllo del vuoto alla fonte del vuoto, quindi la parte anteriore della scatola al perno elastico. Per eseguire la calibrazione della deformazione, scegliere un campo di interesse contenente un'alta densità di perline e grumi di perline riconoscibili per l'utente. Acquisire un'immagine a riposo del campo visivo selezionato e salvare la posizione. Applicare l'allungamento a un livello di vuoto basso di 20 millibar negativi, provocando il movimento in tutte le direzioni. A questo punto, rimettere a fuoco il piano Z e spostare lo stage in direzioni XY per individuare la stessa regione di interesse e acquisire un'immagine nello stato allungato. Quindi, rilascia il ceppo e ripeti i passaggi con un livello di vuoto più alto. Archiviare le immagini acquisite in una cartella organizzata per campione. Nome, l'immagine del tallone di riferimento acquisita senza allungamento come reference_str1 e le immagini allungate a livelli di vuoto crescenti come stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3 e così via. Per quantificare la deformazione, aprire MATLAB e caricare il codice del ceppo gel. Dopo aver impostato i parametri, definisci il percorso padre e la cartella dell'esperimento ed esegui il codice. Quindi, apri stretched_str1 come richiesto dal codice, seguito dal reference_str1. Ora, calcola la matrice di deformazione mediana per ogni livello di vuoto. Dopo aver ripetuto questo processo per almeno tre campioni, tracciare la matrice di deformazione mediana rispetto al livello di vuoto per ottenere la curva di calibrazione. Per rivestire l'anello PDMS, sterilizzarlo sotto la luce ultravioletta per 15 minuti. Sotto una cappa di biosicurezza, sciacquare la piastra sotto la cappa con PBS sterile. Dopo aver aspirato tutto il PBS utilizzato per risciacquare la piastra. Depositare una goccia da 100 a 200 microlitri della soluzione al centro dell'anello. Disegnare il perimetro della goccia con un pennarello indelebile dal lato inferiore della membrana PDMS e incubarla. Il giorno dell'esperimento, lavare la proteina di adesione con PBS. Dopo aver tripsinizzato le cellule, procedere al conteggio delle cellule. Seminare un numero adeguato di cellule in un piccolo volume di circa 20-50 microlitri con terreni cellulari standard per favorire l'adesione e incubarlo in un incubatore ad anidride carbonica con controllo dell'umidità. Dopo 20-30 minuti, aggiungere delicatamente 500 microlitri di terreno sopra le cellule e rimettere la piastra nell'incubatore per consentire un'ulteriore diffusione delle cellule. Per un singolo ciclo di rilascio dell'allungamento e dell'imaging, montare l'anello elastico sul tavolino del microscopio come dimostrato in precedenza. Dopo aver individuato una cella di interesse, registrare la sua posizione e acquisire un'immagine della cella pre-allungata. Applicare il livello di vuoto desiderato corrispondente alla deformazione del substrato richiesta in base alla curva di calibrazione per allungare la cella. Per individuare la cella di stiramento, per prima cosa, rimettere a fuoco il piano Z. Quindi, spostati nelle direzioni XY per centrare la cella nel campo visivo. Registrare le immagini durante la durata desiderata. Navigare fino alla posizione originale della cella e attivare la modalità di acquisizione del microscopio per assicurarsi che l'acquisizione dell'immagine inizi immediatamente dopo la rimessa a fuoco. Rilasciare l'allungamento e rimettere rapidamente a fuoco manualmente nel piano Z. Cattura le immagini della cella rilasciata per il tempo richiesto, regolando manualmente la messa a fuoco durante l'acquisizione. Per la post-elaborazione, aprire Fiji e caricare le immagini acquisite a riposo e durante lo sforzo. Utilizza la corrispondenza del modello di plug-in Fiji per selezionare una regione della cella per l'allineamento. La taratura ha garantito la riproducibilità e il controllo della deformazione applicata, confermando una relazione quasi lineare tra vuoto e deformazione fino al 20%. L'analisi dello spostamento radiale ha dimostrato l'isotropia e l'omogeneità della deformazione sulla membrana PDMS. L'imaging a fluorescenza delle cellule fibroblastiche sottoposte a stiramento di cellule vive ha rivelato invaginazioni di membrana al rilascio di stiramento, che si sono riassorbite entro tre-cinque minuti. Il restretching delle cellule fisse ha consentito l'imaging in uno stato allungato, prevenendo artefatti di ripiegamento artificiale. La membrana PDMS con una griglia modellata ha facilitato l'imaging multimodale, consentendo la localizzazione delle stesse cellule in fluorescenza e microscopia elettronica a scansione. Le cellule posizionate su morbidi gel di PAA rivestiti con fibronectina hanno formato aderenze focali solo quando sottoposte a specifici cicli di allungamento ciclico rispetto alle cellule non allungate.