Cattura delle rotture di siti fragili comuni mediante γH2A nativo. X ChIP

Il nostro lusso si concentra sulla perdita di datazione, il ruolo dell'instabilità del sito fragile comune nel jive nella ri-genesi del tumore. Cercate di identificare le mobilità virali nelle cellule tumorali dell'oncogene gyron che possono essere sfruttate, terapeuticamente. In caso contrario, l'imaging e le tecnologie di sequenziamento, come la simpatia cellulare singola e l'imaging di cellule vive, forniscono una mappatura ad alta risoluzione dell'instabilità genomica in massa.

I modelli in vivo della regione, tra cui il rumore, i modelli murini geneticamente modificati e i sistemi di basi CRISPR che ci circondano per studiare in dettaglio i meccanismi dell'instabilità genomica dell'oncogene. L'interesse a lungo termine del nostro laboratorio è l'identificazione di punti deboli specifici nelle cellule tumorali che possono essere trattate strategicamente per trattamenti infetti, con particolare attenzione alla riduzione al minimo del danno alle cellule normali. Ciò include l'esplorazione delle vulnerabilità genetiche ed epigenetiche per scoprire normali opportunità terapeutiche.

Per iniziare, trattare le cellule T HEK 293 con DMSO etildecolina e idrossiurea in tre diverse piastre per 24 ore. Dopo aver lavato le celle due volte con PBS, centrifugarle a 500 G quattro minuti e cinque minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone freddo A appena preparato e incubare su ghiaccio per cinque-10 minuti.

Osservare la progressione della lisi al microscopio ottico per confermare la completa lisi cellulare. Una volta lisata, centrifugare la sospensione cellulare a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, e risospendere il pellet di nuclei in 500 microlitri di tampone freddo A.Centrifugare di nuovo, e risospendere i nuclei intatti con 100 microlitri di tampone nucleasi micrococcica pipettando da cinque a 10 volte. Aggiungere immediatamente la quantità predeterminata di nucleasi micrococcica ai campioni.

Posizionare i tubi su un rotatore per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Rimettere immediatamente i tubi nel ghiaccio e aggiungere EDTA per terminare la digestione. Dopo il vortice, aggiungere 500 microlitri di tampone B e pipettare su e giù per la miscelazione.

Incubare la provetta con ghiaccio per cinque minuti per solubilizzare le proteine. Per pellettare il materiale insolubile, centrifugare i campioni alla massima velocità per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante chiaro in nuove provette da 1,5 millilitri, etichettate come frazione nativa della cromatina.

Per verificare la frammentazione della cromatina, aliquotare 10 microlitri di surnatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Mescolare il surnatante con 20 microlitri di acqua distillata e 30 microlitri di alcol isoamilico fenolo cloroformio. Dopo un vigoroso vortice, centrifugare le provette a 20.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e osservare tre strati distinti: uno strato superiore trasparente, uno strato intermedio bianco e uno strato inferiore giallo.

Trasferire con cura 20 microlitri della fase acquosa superiore, contenente il DNA, in una nuova provetta. Separare il DNA purificato in un gel di agarosio all'1,5% per 30 minuti a 100 volt. Visualizza i modelli di digestione, assicurandoti che la dimensione dei frammenti di cromatina sia principalmente compresa tra 200 e 1.000 coppie di basi.

Trasferire 20 microlitri di cromatina digerita in ciascuna provetta, contenente 180 microlitri di tampone di eluizione. Etichettare le provette come campioni di input e conservarle a meno 20 gradi Celsius. Aggiungere 400 microlitri di cromatina digerita in un'altra provetta da 1,5 millilitri per l'immunoprecipitazione della cromatina, o chip.

Trasferire l'anticorpo gamma H2 AX su un campione trattato con DMSO, trattato con etildecolina e trattato con idrossiurea. Posizionare i tubi su un rotatore a quattro gradi Celsius per cinque ore, o preferibilmente durante la notte. Nel frattempo, utilizzando punte a orifizio largo, aliquotare 100 microlitri di perle di proteina magnetica AG di grado chip in un nuovo tubo da 1,5 millilitri.

Posizionare il tubo su un supporto magnetico per un minuto, quindi scartare con cura il liquido. Quindi, risospendere le perle in un millilitro di PBS contenente lo 0,5% di BSA. Ruotare il tubo a quattro gradi Celsius per quattro ore.

Riposizionare il tubo sul supporto magnetico per un minuto ed eliminare il surnatante. Dopo il secondo lavaggio, risospendere le perle precodificate in 100 microlitri di tampone B.Aggiungere 25 microlitri della sospensione di microsfere magnetiche precodificate in ciascuna provetta del campione di chip. Ruotare i tubi a quattro gradi Celsius per due ore, quindi posizionare i tubi del chip su un supporto magnetico e attendere che le perline si attacchino al lato del tubo e la soluzione diventi limpida.

Scartare il surnatante trasparente senza disturbare le microsfere magnetiche. Risospendere le perle in un millilitro di tampone di lavaggio e ruotare a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Riposizionare i tubi sul supporto magnetico e attendere che la soluzione diventi limpida prima di gettare il tampone di lavaggio.

Dopo il lavaggio finale, centrifugare brevemente le provette a 400 G per 30 secondi a quattro gradi Celsius per rimuovere il liquido residuo. Riposizionare i tubi sul supporto magnetico e rimuovere con cautela il liquido rimanente dal fondo del tubo. Dopo aver verificato l'efficienza di pull down dell'anticorpo del chip, utilizzando il western blot, aggiungere 50 microlitri di tampone di eluizione a ciascuno dei campioni di chip rimanenti.

Posizionare i tubi su un mixer Therma e agitare per 15 minuti a temperatura ambiente. Posizionare i tubi su un supporto magnetico per un minuto e raccogliere l'eluit in nuovi tubi. Aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione a ciascun campione di eluizione del chip e 180 microlitri di tampone di eluizione a ciascun campione di input.

Quindi aggiungere 200 microlitri di alcol isoamilico fenolo cloroformio a ciascun campione e agitare energicamente le provette per mescolare. Dopo aver centrifugato i campioni, trasferire con cura lo strato acquoso superiore nelle provette contenenti 19 microlitri di acetato di sodio tre molari e due microlitri di soluzione di glicogeno. Mescolare facendo vorticare i tubi.

Aggiungere 500 microlitri di etanolo al 100% a ciascun campione e agitare accuratamente. Posizionare le provette a meno 20 gradi Celsius per due ore o durante la notte per far precipitare il DNA. Quindi centrifugare le provette prima di scartare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di etanolo al 70%.

Una volta rimosso l'etanolo residuo mediante centrifugazione, asciugare all'aria i pellet di DNA per due o tre minuti prima di rimetterli in sospensione in 400 microlitri di tampone TE. Concentrazioni più elevate di nucleasi micrococcica hanno portato a una digestione più estesa della cromatina, con conseguente predominanza di frammenti mononucleosomici. Al contrario, a concentrazioni più basse di nucleasi micrococcica, la maggior parte dei frammenti di cromatina erano più grandi, spesso superiori a un chilogrammo di base.

I livelli di Gamma H2 AX erano significativamente elevati nelle cellule stressate dalla replicazione, trattate con etil decolina, rispetto ai controlli trattati con DMSO, come mostrato nei campioni di input sia per il chip nativo che per il chip reticolato.