Mappatura meccanica degli sferoidi tramite spettroscopia di Brillouin

Stiamo utilizzando la spettroscopia di Brillouin per valutare in modo non invasivo la meccanica cellulare al fine di comprendere il ruolo della meccanobiologia nella progressione della malattia. Le tecnologie non invasive, come la spettroscopia di Brillouin, ci permettono di caratterizzare la meccanica in tre dimensioni, ma senza disturbare il campione. Per cominciare, pretrattare i pozzi della piastra micropozzo aggiungendo 500 microlitri di soluzione antiaderente per risciacquo pozzetto.

Centrifuga la piastra a 1.300 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver eliminato le bolle d'aria, rimuovere la soluzione antiaderente dai pozzi. Successivamente, aggiungi un millilitro di PBS in ogni pozzo e aspiralo completamente.

Dopo aver ripetuto il lavaggio PBS, determinare il numero di cellule per sferoide e il numero di sferoidi per gel secondo il disegno sperimentale. Mettere le cellule in pellet e riappenderle in un millilitro di DMEM integrato. Poi aggiungi un millilitro di questa sospensione a celle in un pozzetto della piastra del micropozzo e mescola bene.

Centrifuga la piastra a 100 g per tre minuti a temperatura ambiente. Osserva la piastra del micropozzo al microscopio per confermare una distribuzione uniforme delle cellule e che si siano depositate sul fondo dei pozzi. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 24 ore per permettere la formazione degli sferoidi.

Per raccogliere gli sferoidi, rimuovere delicatamente e lentamente i supporti culturali senza disturbare gli sferoidi. Taglia la punta della pipetta rivestita PBS/FBS per allargare l'apertura e aggiungi 500 microlitri di PBS in ogni pozzo per spostare gli sferoidi. Raccogli il PBS contenente gli sferoidi in un tubo.

Poi trasferire 50 microlitri della sospensione sferoide in un pozzetto di una piastra da 96 pozzi. Per facilitare il conteggio, disegna una croce sul fondo del pozzo usando un pennarello permanente e contate il numero di sferoidi in questo volume al microscopio. Usa l'equazione per calcolare il numero totale di sferoidi.

Apri il software SpectraLok e aspetta che tutti i dispositivi connessi siano rilevati. Poi seleziona la telecamera dello spettrometro. Installa il cubo acrilico sul portacampioni del microscopio con il lato trasparente rivolto verso l'obiettivo obiettivo.

Abbassa l'obiettivo il più possibile e centra il cubo sotto di essa. Assicurati che il percorso ottico nel microscopio sia impostato in modo che la fotocamera dello spettrometro venga esposta girando il selettore della porta rotante per L.In la finestra della SpectraLok Camera, imposta il tempo di esposizione del sensore a 500 millisecondi e il guadagno software a 100. Premi Cattura e muovi lentamente l'obiettivo verso l'alto.

Continua ad alzare la lente finché i picchi di Brillouin non diventano visibili e la loro intensità si stabilizza, indicando che il punto focale è posizionato all'interno del cubo acrilico. Ora, apri la finestra di controllo Pump Killer, o PK. Zooma su uno degli ordini Brillouin più luminosi e regola la posizione dell'attuatore di pressione a incrementi di 100 micrometri cliccando su move rel per minimizzare l'intensità massima di Rayleigh.

Se il segnale di Rayleigh aumenta, clicca su Reverse per cambiare la direzione di regolazione. Quando l'intensità massima di Rayleigh diminuisce, si regola fine la pressione dell'etalon in incrementi minori di 10 micrometri. Nella finestra della Fotocamera, zooma su uno degli ordini Brillouin.

Premi S per visualizzare le strisce su cui la LUT viene applicata all'immagine della telecamera. Apri la finestra Impostazioni e premi Calibrazione Rapida per ricalcolare automaticamente lo spostamento orizzontale ottimale delle strisce. Dopo aver verificato l'allineamento delle strisce, regolare gli assi delle lenti collimatore per massimizzare l'efficienza di accoppiamento della luce dal Pump Killer allo spettrometro.

Poi apri la finestra di Spectrum e clicca su Srotolato per recuperare lo spettro. In un cubo acrilico omogeneo, punta a una completa soppressione del segnale di Rayleigh e regola finché il segnale di Brillouin non è chiaramente visibile. Per salvare i parametri ottimizzati, clicca su Aggiorna Tutto, e poi Salva Tutto nella finestra di controllo PK.

Infine, nella finestra principale, clicca su Salva nella sezione File I/O per memorizzare la configurazione. Dopo aver aperto il software di scansione, installare la piastra di Petri con fondo di vetro contenente il campione di sferoide idrogel al posto del cubo acrilico. Rimuovi il coperchio della piastra di Petri, aggiungi abbastanza substrato per immergere il gel e posiziona sopra un copertino per evitare il movimento del gel.

Individua lo sferoide bloccando prima il raggio laser. Sposta il percorso ottico del microscopio sull'oculare e accendi l'illuminazione a luce bianca. Usando il joystick, controlla manualmente lo stadio campione per localizzare e mettere a fuoco lo sferoide.

Acquisire un'immagine in campo chiaro dello sferoide e regolare la luminosità dell'illuminazione ruotando la ruota di controllo. Cambia il percorso ottico su R per esporre la fotocamera del microscopio e imposta il tempo di esposizione secondo necessità. Successivamente, imposta la porta del microscopio su L e cattura lo sfondo con il laser ancora bloccato.

Sblocca il laser e, a seconda del rapporto segnale/rumore desiderato, seleziona un tempo di esposizione tra 200 e 500 millisecondi. Dallo spettro non avvolto, seleziona la gamma di fitting Brillouin Peak. Regolare il valore soglia a circa metà dell'intensità di picco di Brillouin ed escludere qualsiasi picco di Brillouin con ampiezza inferiore alla soglia.

Applicare la correzione della lunghezza d'onda al laser in base a tutte le coppie di picchi di Brillouin identificate. Infine, scegli la geometria della scansione raster regolando la larghezza e la dimensione del passo, e avvia la scansione per registrare le misurazioni. Immagini rappresentative di uno sferoide di cellule staminali mesenchimale incorporato nell'idrogel hanno mostrato mappe distinte di spostamento e larghezza di linea di Brillouin insieme a corrispondenti immagini di fluorescenza del campo chiaro, dei nuclei e dei filamenti di actina.

La mappa di spostamento di frequenza Brillouin a bassa risoluzione è stata segmentata in regioni gel e sferoidi basate sul contorno tracciato manualmente dall'immagine del campo chiaro. I pixel ambigui derivanti dal down-sampling sono stati esclusi dall'analisi, mentre maschere binarie chiare per le regioni gel e sferoide sono state create per estrarre i valori BFS. Il confronto tra mappe BFS ad alta e bassa risoluzione ha dimostrato che il campionamento di carotaggio forniva valori medi BFS comparabili alle scansioni ad alta risoluzione, indicando una misurazione coerente della meccanica del blocco degli sferoidi.

Il nostro protocollo fornirà una piattaforma che permetterà ai ricercatori di studiare molte malattie legate alla meccanobiologia. Sarà interessante vedere se i cambiamenti nello spostamento di Brillouin che si correlano con le proprietà meccaniche cellulari siano indicatori efficaci per le fasi della progressione della malattia. Valuteremo come i trattamenti farmacologici influenzino la meccanica degli sferoidi su scale temporali che imitano la progressione della malattia.