Metodo efficiente per l'imaging dei polmoni murini che preserva la dinamica spaziale delle spore fungine nelle vie aeree

Questa ricerca mira a stabilire un protocollo efficiente per preservare il contenuto delle vie aeree dei topi in modelli di infezione polmonare. Stiamo sviluppando la capacità di rispondere alla domanda su dove finiscono le spore fungine inalate nei polmoni. Recentemente, molti gruppi hanno identificato ruoli per varie cellule epiteliali delle vie aeree nel rilevamento delle infezioni e nell'avvio di risposte immunitarie protettive.

Queste cellule epiteliali vanno dalle cellule club nei bronchi alle cellule epiteliali di tipo II negli alveoli terminali. La tecnica comune di preparazione del polmone consiste nel gonfiare il polmone con il fissativo liquido per preservare il tessuto polmonare per le analisi istologiche a valle. Tuttavia, questa tecnica sposta il contenuto delle vie aeree, come le spore fungine inalate.

Il nostro protocollo preserva la posizione naturale delle spore fungine inalate nel polmone, mantenendo al contempo una corretta morfologia polmonare attraverso il gonfiaggio dell'aria e una corretta fissazione polmonare attraverso la perfusione vascolare. Speriamo di utilizzare questo protocollo per caratterizzare le giunzioni broncoalveolari dove le spore sembrano atterrare nel nostro modello, ma utilizzeremo le posizioni delle spore in prossimità di varie cellule epiteliali e studieremo le risposte immunitarie risultanti. Per iniziare, colorare una volta per 10 alla potenza di sei spore di Coccidioides posadasii con cinque concentrazioni micromolari di CFSE per 30 minuti a 30 gradi Celsius.

Dopo la colorazione, lavare le spore con PBS. Centrifugare le spore a 12.000 g e risospendere il pellet in 25 microlitri di PBS per inoculo di spore alla concentrazione appropriata. Preparare una pipetta con 25 microlitri di inoculo di spore.

Dopo aver anestetizzato il topo in un barattolo di Nalgene, posizionarlo in posizione supina con una mano e lasciarlo fare da tre a cinque respiri ansimanti regolari. Posizionare la punta della pipetta nella parte posteriore dell'orofaringe del topo e rilasciare l'inoculo durante l'inalazione. Avvertire crepitii sugli aspetti posteriore e anteriore del torace del topo con la mano e il pollice per confermare l'inalazione dell'inoculo.

Spruzzare il topo profondamente anestetizzato con etanolo al 70%. Usando le forbici, taglia con cura la pelle del topo, quindi separala per esporre il peritoneo. Quindi, tira la pelle dalla metà superiore sopra la testa del topo, liberando le braccia.

Ora, taglia la membrana peritoneale allo sterno e lungo la faccia inferiore della gabbia toracica, esponendo il peritoneo. Sposta il fegato inferiormente per rivelare il diaframma. Usa le forbici per perforare con cura il diaframma lontano dal parenchima polmonare.

Quindi, taglia la gabbia toracica sul lato sinistro per esporre il cuore. Utilizzando un ago calibro 30, iniettare da cinque a 10 millilitri di PBS nel ventricolo destro. Dopo aver rimosso l'ago, utilizzare un ago nuovo per iniettare cinque millilitri di formalina tamponata neutra al 10% nel ventricolo destro.

Usando le forbici, rimuovi la metà anteriore della gabbia toracica. Per esporre la trachea, tagliare le costole superiori e le clavicole a destra e a sinistra del collo, evitando la linea mediana dove si trova la trachea. Usando una pinza, afferra le costole superiori e le clavicole rimanenti vicino alla linea mediana del collo e tira superiormente fino a quando la trachea non è esposta.

Prepara un filo di sutura di 10 centimetri e tiralo sotto la trachea. Pre-fare un nodo sciolto all'estremità inferiore della trachea esposta. Quindi, preparare una siringa da un millilitro d'aria con un catetere calibro 18.

Usando un ago calibro 18, fai un foro nella trachea all'estremità superiore della regione esposta. Ora, inserisci il catetere nel foro, assicurandoti che sia ben aderente per evitare la fuoriuscita dell'aria. Quindi, iniettare lentamente un millilitro d'aria nei polmoni per 10 secondi, osservando il gonfiaggio di tutti i lobi polmonari.

Il gonfiaggio completo fa sì che i polmoni si avvolgano leggermente attorno al cuore e riempiano il volume occupato nel diaframma non perforato. Dopo aver isolato i polmoni dal topo, posizionarlo sul bordo superiore di una provetta conica da 50 millilitri riempita con 20 millilitri di formalina tamponata neutra al 10%. Posizionare i fili di sutura all'esterno del tubo, quindi avvitare il tappo.

Per iniziare, sciacquare i polmoni isolati del topo in PBS e metterli in una soluzione di PBS al 30% di saccarosio per 72-96 ore a quattro gradi Celsius. Successivamente, rimuovere il tessuto in eccesso e posizionare i polmoni in un criomold con terreno OCT. Congelare il campione a meno 80 gradi Celsius.

Equilibrare il campione nei crioblocchi OCT a meno 20 gradi Celsius per un'ora prima di sezionare i blocchi a uno spessore compreso tra 20 e 100 micrometri. Raccogli le sezioni su un vetrino e lasciale asciugare per 30 minuti o un'ora. Posizionare il vetrino in un bagno PBS a temperatura ambiente per 30 minuti per rimuovere l'OCT dal tessuto.

Quindi, utilizzare una salvietta per rimuovere eventuali goccioline in eccesso dal perimetro del vetrino attorno al campione di tessuto. Disegnare un perimetro attorno al campione sul vetrino utilizzando una penna PAP idrofoba e lasciarlo asciugare per cinque minuti. Successivamente, aggiungere 300 microlitri di soluzione bloccante animal-free appena preparata sul vetrino e incubare a temperatura ambiente.

Ora, incubare il vetrino in 300 microlitri di soluzione primaria di anticorpi EpCAM coniugati per ratti Fluor 647 durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione anticorpale e lavare due volte il vetrino con 300 microlitri di PBS per cinque minuti. Dopo l'asciugatura, aggiungere una goccia di terreno di montaggio in vetro SlowFade soft-set a temperatura ambiente su ciascun pezzo di tessuto.

Posizionare un vetrino coprioggetti sul tessuto, assicurandosi che si estenda oltre il campione e il perimetro del marcatore idrofobico. Per iniziare, posizionare la sezione polmonare di topo inoculata con spore fungine e immunocolorata sotto un microscopio fluorescente multicanale e selezionare un obiettivo appropriato. Per catturare l'intero lobo polmonare, raccogli un numero sufficiente di tessere dell'immagine e uniscile insieme.

Utilizzando il software del microscopio, è possibile esportare l'immagine dell'intero lobo polmonare per l'elaborazione a valle. In QuPath, crea un file di progetto e aggiungi le immagini fluorescenti al file. Classificare i pixel positivi all'EpCAM come epitelio selezionando in sequenza Classifica, Classificazione pixel e Crea soglia.

Selezionare la risoluzione, il canale, il sigma di levigatura e il valore di soglia per identificare la regione di destinazione. Salvare il classificatore con un nome univoco e selezionare Crea oggetti. Nella nuova finestra Crea oggetti, selezionare Nuovo tipo di oggetto come Annotazione.

Per l'epitelio polmonare, impostare la dimensione minima dell'oggetto e la dimensione minima del foro su 100 micrometri quadrati. Dopo aver selezionato OK, le annotazioni verranno create e potranno essere modificate utilizzando lo strumento pennello. Per classificare le spore, ripetere i passaggi come dimostrato per le annotazioni dell'epitelio polmonare.

Quindi, dalla finestra Crea oggetti, selezionare Rilevamento come nuovo tipo di oggetto. Impostare la dimensione minima dell'oggetto e la dimensione minima del foro su zero micrometri quadrati e selezionare Dividi oggetti. Successivamente, per eseguire l'analisi spaziale delle spore in sequenza, selezionare Analizza, Analisi spaziale e calcolare la distanza con segno dalle annotazioni bidimensionali.

Le distanze dall'epitelio positivo per EpCAM saranno calcolate per ogni spora rilevata. Infine, fai clic su Misura, seguito da Esporta misurazioni per esportare i risultati. Le spore di Coccidioides posadasii si sono accumulate principalmente nei bronchi distali e negli spazi alveolari vicini nei polmoni gonfiati dall'aria.

Le spore apparivano più disperse lontano dai bronchi nei polmoni formali e gonfiati di liquido rispetto ai polmoni gonfiati ad aria. La distanza tra le spore e l'epitelio bronchiolare positivo per EpCAM era maggiore nei polmoni gonfiati con liquido rispetto al gonfiaggio fisiologico dell'aria, indicando spore più disperse.