Name: Metodo efficiente per limaging dei polmoni murini che preserva la dinamica spaziale delle spore fungine nelle vie aeree (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Scopri un metodo efficiente per l'imaging dei polmoni murini che preserva la posizione naturale delle spore fungine nelle vie aeree. Questo protocollo consente l'analisi dettagliata tramite microscopia a fluorescenza per studiare la patogenesi fungina.

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Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) di Rutgers Biomedical Health Sciences.
1. Marcare le spore con fluorescenza intracellulare
<ol>
	<li>Colorare 1 x 106 spore in carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE), Cell Tracker Orange o Cell Tracker Red (o colorante intracellulare a scelta) a 5 μM per 30 minuti a 30 °C, quindi lavare con PBS e centrifugare le spore a 12.000 x g. Ripetere questo lavaggio una volta.</li>
	<li>Preparare l'inoculo di spore alla concentrazione appropriata in modo che 25 μl contengano la dose di spore appropriata per un topo.</li>
</ol>
2. Inoculazione di spore nel topo mediante inalazione per aspirazione mediante anestesia con isoflurano
ATTENZIONE: L'isoflurano è un agente anestetico volatile e deve essere utilizzato all'interno di una cabina di biosicurezza canalizzata o di una cappa aspirante.
<ol>
	<li>Per preparare il barattolo per l'esposizione all'isoflurano, metti un tovagliolo piegato in un barattolo Nalgene da 1 litro con tappo a vite e posiziona un cerchio di rete di plastica sopra il tovagliolo come piattaforma per i topi. Aggiungere 2 ml di isoflurano al tovagliolo, chiudere il barattolo e attendere 1-2 minuti affinché il gas si equilibri nel contenitore.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig01.jpg"> 
Figura 1: Apparecchio per il metodo di inoculazione delle spore a goccia aperta di isoflurano. Un tovagliolo piegato viene posizionato sul fondo di un barattolo con tappo a vite da 1 L, quindi viene inserita una rete circolare di plastica che funge da piattaforma per i topi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="2">
	<li>Prima di esporre il topo all'anestesia, preparare una pipetta con 25 μl di inoculo. Posizionare il topo nel contenitore dell'isoflurano e inclinare il contenitore per monitorare la perdita del riflesso raddrizzante, dove il topo ha perso conoscenza ed è capovolto. Questo di solito richiede circa 10 s.</li>
	<li>Monitorare la frequenza respiratoria (RR) fino a quando non rallenta a 50-80 respiri al minuto (bpm), circa il 50% della RR a riposo. Questo di solito richiede altri 10 secondi. A questo punto, rimuovere il topo dal barattolo di isoflurano. NOTA: Questa è un'alta concentrazione di isoflurano, che produrrà una rapida induzione dell'anestesia, e il topo deve essere monitorato molto attentamente. Il sovradosaggio letale di isoflurano è un rischio, poiché la concentrazione di isoflurano può essere variabile e la curva dose-risposta all'isoflurano è molto ripida. Se la frequenza respiratoria scende al di sotto di 50 bpm e/o è irregolare, rimuovere il topo dall'isoflurano, lasciarlo recuperare per 3-5 minuti e riprovare (un massimo di due tentativi ripetuti).</li>
	<li>Confermare la profondità dell'anestetico in caso di mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi. Quindi, posiziona il mouse in posizione supina con una mano e consenti al mouse di fare 3-5 respiri ansimanti regolari con velocità crescente (a partire da 50-60 bpm) e vigore. All'inizio, posizionare la punta della pipetta nella parte posteriore dell'orofaringe del topo e rilasciare l'inoculo durante l'inalazione. NOTA: Questi rantoli attraverso la bocca scuotono la testa inferiormente a causa del reclutamento di muscoli accessori per la respirazione. Quando la pipetta viene inserita durante questi sussulti, la bocca dovrebbe aprirsi ad ogni rantolo. Se la bocca non si apre, il topo non è sufficientemente anestetizzato e probabilmente non inalerà il contenuto dall'orofaringe. La pipetta deve premere la lingua, spingendola verso il fondo e la parte anteriore della bocca per evitare l'ingestione dell'inoculo. Quando la pipetta è in bocca e il topo è adeguatamente anestetizzato, il topo aprirà la bocca ad ogni rantolo.</li>
	<li>Con la mano e il pollice che tengono il topo, sentire la presenza di crepitii sugli aspetti posteriore e anteriore del torace del topo per confermare l'inalazione dell'inoculo.</li>
</ol>
3. Eutanasia dei topi
<ol>
	<li>Iniettare nel topo per via intraperitoneale un cocktail di 200 mg/kg di ketamina e 24 mg/kg di xilazina 10 minuti prima del momento del sacrificio.</li>
	<li>Attendere 10 minuti dopo l'iniezione fino a quando il topo entra in un piano chirurgico di anestesia, confermato dalla mancanza di risposta al pizzicamento delle dita.</li>
</ol>
4. Perfusione dei polmoni con PBS e formalina
<ol>
	<li>Spruzzare il topo anestetizzato con etanolo al 70%. Usa le forbici per tagliare la pelle del mouse e separare la pelle per esporre il peritoneo su tutti i lati. Tirare la pelle dalla metà superiore del topo sopra la sua testa, estraendo le braccia dalla pelle.</li>
	<li>Tagliare la membrana peritoneale allo sterno e lungo la faccia inferiore della gabbia toracica, esponendo il peritoneo. Sposta il fegato inferiormente, rivelando il diaframma. Usa le forbici per perforare con cura il diaframma lontano dal parenchima polmonare per evitare di perforare un foro nei polmoni stessi. NOTA: La perforazione involontaria dei polmoni renderà impossibile il successivo gonfiaggio dell'aria.</li>
	<li>Dopo che il diaframma è stato perforato, l'aria entra nel torace, facendo collassare i polmoni. Taglia la gabbia toracica sul lato sinistro per rivelare il cuore. Iniettare 5-10 ml di PBS nel ventricolo destro con un ago da 30 G a una velocità di 1 ml per 5 s (per evitare di danneggiare i vasi), sbiancando rapidamente i polmoni. ATTENZIONE: La formalina è una sostanza volatile pericolosa che deve essere maneggiata all'interno di una cabina di biosicurezza canalizzata o di una cappa aspirante.</li>
	<li>Al termine, rimuovere l'ago e utilizzare un nuovo ago per iniettare 5 mL di formalina tamponata neutra (NBF) al 10% nel ventricolo destro alla stessa velocità.</li>
</ol>
5. Gonfiare l'aria del polmone perfuso
<ol>
	<li>Rimuovere la metà anteriore della gabbia toracica. Per esporre la trachea, tagliare le costole superiori e le clavicole a destra e a sinistra del collo. Fare attenzione a evitare di tagliare vicino alla linea mediana dove si troverà la trachea. Con una pinza, afferrare le costole superiori e le clavicole rimanenti sulla linea mediana del collo e tirare superiormente fino a quando la trachea non è esposta.</li>
	<li>Preparare un filo di sutura di 10 cm di lunghezza, tirarlo sotto la trachea e pre-legare un nodo sciolto all'estremità inferiore della trachea esposta. Preparare una siringa da 1 ml di aria con un catetere da 18 G. Utilizzare un ago da 18 G per praticare un foro nella trachea all'estremità superiore della regione esposta.</li>
	<li>Posizionare il catetere in quel foro, assicurandosi che si adatti relativamente bene per evitare la fuoriuscita dell'aria. Iniettare lentamente 1 ml di aria nei polmoni nel corso di 10 s, osservando il gonfiaggio polmonare di tutti i lobi. Il gonfiaggio completo fa sì che i polmoni si avvolgano leggermente intorno al cuore e riempiano il volume che occupano nel diaframma non perforato.</li>
	<li>Tirare il nodo stretto attorno alla trachea e rimuovere il catetere. Tenere la trachea e usare le forbici smussate per rimuovere i polmoni dal topo, facendo attenzione a non perforare il polmone.</li>
</ol>
6. Fissazione per immersione e disidratazione
<ol>
	<li>Posizionare i polmoni sul bordo superiore di una provetta conica da 50 mL riempita con 20 mL di NBF al 10%. Tenere i fili di sutura all'esterno del conico, avvitare il tappo e capovolgere il conico in modo che i polmoni siano sospesi a testa in giù in 20 ml di NBF. Posizionare a 4 °C per 24-48 h.</li>
	<li>Sciacquare i polmoni in PBS, quindi immergerli in una soluzione di saccarosio-PBS al 30% (p/v) per 72-96 ore a 4 °C per disidratare i polmoni in preparazione alla crioconservazione. Rimuovere i polmoni dal saccarosio, posizionare i polmoni in un criomold con temperatura di taglio ottimale (OCT) e congelare il campione a -80 °C.</li>
</ol>
7. Criosezione
<ol>
	<li>Equilibrare i campioni nei crioblocchi OCT alla temperatura di -20 °C del criostato per 1 ora prima del sezionamento. Sezionare i blocchi con spessori di 20-100 μm. NOTA: Il gonfiaggio dell'aria può portare a una maggiore fragilità del campione e il taglio a uno spessore maggiore può prevenire la rottura del tessuto durante il sezionamento.</li>
	<li>Raccogliere le sezioni sui vetrini e lasciarle asciugare per 30 minuti a 1 ora per garantire l'aderenza dei tessuti al vetrino. NOTA: In questa fase i vetrini possono essere mantenuti a -80 °C.</li>
</ol>
8. Preparazione e blocco dei vetrini
<ol>
	<li>Posizionare i vetrini nel bagno PBS (in un piatto o in un barattolo Coplin) per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) per rimuovere l'OCT dai vetrini. NOTA: Le sezioni più spesse (40-100 μm) potrebbero non aderire ai vetrini così come le sezioni più sottili, quindi è meglio tenerle piatte e verticali in un piatto piuttosto che metterle su un lato in un barattolo Coplin.</li>
	<li>Asciugare i vetrini dopo che l'OCT si è dissolto dal tessuto. Utilizzare una salvietta per asciugare le goccioline in eccesso dal perimetro del vetrino attorno al campione di tessuto. </li>
	<li>Usa un Pap pen idrofobo per disegnare un perimetro attorno al campione e lascialo asciugare per 5 minuti.</li>
	<li>Preparare un tampone bloccante di soluzione bloccante animal-free con Tween-20 allo 0,3% e blocco Fc 1:100 in 300 mL per vetrino. NOTA: Per bersagli intracellulari, può essere utilizzato l'1% di Tween-20. Un volume di 300 μl è solitamente sufficiente, ma il volume necessario per coprire completamente il tessuto dipende dalla dimensione perimetrale del marcatore idrofobico. Il tessuto non dovrebbe asciugarsi da questo punto in poi.</li>
	<li>Lasciare la soluzione bloccante sui vetrini per 1 ora a RT.</li>
</ol>
9. Immunocolorazione
<ol>
	<li>Lavare il vetrino pipettando il fluido e aggiungendo 300-500 μl di PBS. Ripetere il lavaggio una volta.</li>
	<li>Preparare l'anticorpo primario AlexaFluor-647 coniugato EpCAM (clone G8.8) di ratto (clone G8.8) in soluzione bloccante priva di animali con lo 0,33% di Tween-20 (o l'1% per i bersagli intracellulari). Aggiungere 300 μl per vetrino di questa soluzione e colorare per una notte a 4 °C. NOTA: Gli anticorpi devono essere testati empiricamente per la concentrazione, il tempo e la temperatura di colorazione. Le sezioni sottili (8-20 μm) vengono colorate per 30 minuti a 37 °C e le sezioni più spesse (20-100 μm) a 4 °C durante la notte utilizzando diluizioni 1:100 per la maggior parte degli anticorpi. Se si utilizzano anticorpi non coniugati, lavare 2 volte (come sopra) e applicare un anticorpo fluorescente secondario per un tempo e una temperatura determinati empiricamente. Generalmente, la colorazione secondaria degli anticorpi viene eseguita a RT per 1 ora a diluizione 1:1000.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di anticorpi dal campione e lavare il vetrino con 300 mL di PBS per 5 minuti. Ripetere questo lavaggio una volta. Asciugare i vetrini, rimuovendo tutto il liquido in eccesso dal campione e dal vetro circostante.</li>
	<li>Aggiungere una goccia di supporto di montaggio RT soft set (ad es. SlowFade Glass) su ciascun pezzo di tessuto. Fare attenzione a evitare bolle lasciando che la bottiglia si depositi a testa in giù e lasciando cadere lentamente ogni goccia sui fazzoletti. Posizionare un vetrino coprioggetti di dimensioni adeguate per estendersi oltre il perimetro del campione e del marcatore idrofobo.</li>
</ol>
10. Imaging tramite microscopia a fluorescenza
<ol>
	<li>Utilizzare un microscopio a fluorescenza multicanale per scansionare intere sezioni polmonari in modo imparziale utilizzando un obiettivo con risoluzione sufficiente per risolvere le singole spore e le cellule ospiti (ad esempio, Zeiss Axioscan 7 utilizzando un obiettivo a olio 20x con NA = 0,8 o simile). NOTA: Assicurarsi che la potenza del laser e il guadagno di tensione PMT siano impostati per massimizzare i rapporti segnale/rumore del bersaglio sullo sfondo determinati con un controllo a fluorescenza meno uno (FMO).</li>
	<li>Raccogli un numero sufficiente di tessere dell'immagine per catturare l'intero lobo polmonare (ad esempio, ~200 tessere di dimensioni 400 μm x 400 μm). Utilizzare il programma software del microscopio (ad es. Zeiss ZEN 3.7 o simile) per esportare l'immagine della piastrella unita per l'elaborazione a valle.</li>
</ol>
11. Analisi spaziale tramite QuPath
<ol>
	<li>In QuPath, un software open source gratuito14, crea un file di progetto e aggiungi le immagini fluorescenti al file.</li>
	<li>Classificare i pixel EpCAM+ come epitelio facendo clic sull'opzione del menu in alto Classifica, quindi su Classificazione pixel &gt; Crea soglia. Selezionate la risoluzione, il canale, il sigma di levigatura e il valore di soglia che meglio identifica la regione di destinazione. Salvare il classificatore con un nome univoco e selezionare Crea oggetti.</li>
	<li>Nella nuova finestra Crea oggetti , selezionare Nuovo tipo di oggetto come Annotazione. Per l'epitelio polmonare, impostare la dimensione minima dell'oggetto e la dimensione minima del foro su 100 mm2. Non è necessario selezionare Dividi oggetti qui. Dopo aver selezionato OK, le annotazioni verranno create e potranno essere modificate a occhio nudo utilizzando lo strumento Pennello nell'area in alto a sinistra.</li>
	<li>Per classificare le spore, ripetere i passaggi da 11.3 a 11.4 utilizzando il canale in cui sono state catturate le spore e impostare il nuovo tipo di oggetto Rilevamento anziché Annotazione. Impostare la dimensione minima dell'oggetto e la dimensione minima del foro su 0 mm2 e selezionare Dividi oggetti.</li>
	<li>Per eseguire l'analisi spaziale delle spore, selezionare l'opzione di menu in alto Analizza &gt; Analisi spaziale &gt; Calcola distanza con segno dalle annotazioni 2D. Le distanze dall'epitelio EpCAM+ saranno calcolate per ogni spora rilevata. Esportali tramite l'opzione del menu in alto Misura &gt; Esporta misure.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Conservazione della localizzazione delle spore fungine nei polmoni per l'analisi al microscopio a fluorescenza

<ol><li>American Society for Microbiology. One Health: Fungal Pathogens of Humans, Animals, and Plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Report+on+an+American+Academy+of+Microbiology+Colloquium%22">Report on an American Academy of Microbiology Colloquium</a>. , Washington, DC. (2019).</li>
<li>Crossen, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+epithelium+responses+to+invasive+fungal+infections%3A+A+critical+partner+in+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fungi+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Human airway epithelium responses to invasive fungal infections: A critical partner in innate immunity.</a> J Fungi (Basel). 9 (1), 40(2022).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-size+distributions+and+seasonal+diversity+of+allergenic+and+pathogenic+fungi+in+outdoor+air%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air.</a> ISME J. 6 (10), 1801-1811 (2012).</li>
<li>Thakur, A. K., Kaundle, B., Singh, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThakur%2C+AK+%22Mucoadhesive+Drug+Delivery+Systems+in+Respiratory+Diseases.Targeting+Chronic+Inflammatory+Lung+Diseases+Using+Advanced+Drug+Delivery+Systems%22">Mucoadhesive Drug Delivery Systems in Respiratory Diseases.Targeting Chronic Inflammatory Lung Diseases Using Advanced Drug Delivery Systems</a>. , Elsevier, Academic Press. (2020).</li>
<li>Darquenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosol+deposition+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Aerosol+Med+Pulm+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Aerosol deposition in health and disease.</a> J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 25 (3), 140-147 (2012).</li>
<li>Kradin, R. L., Mark, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+pulmonary+disorders+due+to+Aspergillus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">The pathology of pulmonary disorders due to Aspergillus spp.</a> Arch Pathol Lab Med. 132 (4), 606-614 (2008).</li>
<li>Karnak, D., Avery, R. K., Gildea, T. R., Sahoo, D., Mehta, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endobronchial+fungal+disease%3A+An+under-recognized+entity%5BTitle%5D)+AND+%22Respiration%22%5BJournal%5D)">Endobronchial fungal disease: An under-recognized entity.</a> Respiration. 74 (1), 88-104 (2006).</li>
<li>Amich, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+light+sheet+fluorescence+microscopy+of+lungs+to+dissect+local+host+immune-Aspergillus+fumigatus+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-Aspergillus fumigatus interactions.</a> mBio. 11 (1), e02752-e02819 (2020).</li>
<li>Wiesner, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Club+cell+TRPV4+serves+as+a+damage+sensor+driving+lung+allergic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Club cell TRPV4 serves as a damage sensor driving lung allergic inflammation.</a> Cell Host Microbe. 27 (4), 614-628.e6 (2020).</li>
<li>Evans, S. E., Hahn, P. Y., McCann, F., Kottom, T. J., Pavlovic', Z. V., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumocystis+cell+wall+%CE%B2-glucans+stimulate+alveolar+epithelial+cell+chemokine+generation+through+nuclear+factor-%CE%BAB-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Pneumocystis cell wall β-glucans stimulate alveolar epithelial cell chemokine generation through nuclear factor-κB-dependent mechanisms.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (6), 490-497 (2005).</li>
<li>Bauer, C., Krueger, M., Lamm, W. J. E., Glenny, R. W., Beichel, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lapdMouse%3A+associating+lung+anatomy+with+local+particle+deposition+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">lapdMouse: associating lung anatomy with local particle deposition in mice.</a> J Appl Physiol. 128 (2), 309-323 (2020).</li>
<li>Srirama, P. K., Wallis, C. D., Lee, D., Wexler, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extra-thoracic+airways+and+deposited+particles+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Aerosol+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging extra-thoracic airways and deposited particles in laboratory animals.</a> J Aerosol Sci. 45, 40-49 (2012).</li>
<li>Thomas, S. M., Bednarek, J., Janssen, W. J., Hume, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air-inflation+of+murine+lungs+with+vascular+perfusion-fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Air-inflation of murine lungs with vascular perfusion-fixation.</a> J Vis Exp. 168, e62215(2021).</li>
<li>Bankhead, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuPath%3A+Open+source+software+for+digital+pathology+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">QuPath: Open source software for digital pathology image analysis.</a> Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).</li>
<li>Davenport, M. L., Sherrill, T. P., Blackwell, T. S., Edmonds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+and+inflation+of+the+mouse+lung+for+tumor+histology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology.</a> J Vis Exp. 162, e60605(2020).</li>
<li>Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society%2FEuropean+Respiratory+Society%3A+Standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for quantitative assessment of lung structure.</a> Am J Respir Crit Care Med. 181 (4), 394-418 (2010).</li>
<li>Gil, J., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+lining+of+bronchioles+after+perfusion-fixation+of+rat+lungs+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Extracellular lining of bronchioles after perfusion-fixation of rat lungs for electron microscopy.</a> Anat Rec. 169 (2), 185-199 (1971).</li>
<li>Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+fixation+of+lungs+for+structure-function+analysis%3A+credits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+Respir+Environ+Exerc+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 53 (2), 528-533 (1982).</li>
<li>Evans, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymeric+mucin+Muc5ac+is+required+for+allergic+airway+hyperreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The polymeric mucin Muc5ac is required for allergic airway hyperreactivity.</a> Nat Commun. 6, 6281(2015).</li>
<li>Galati, D. F., Asai, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence microscopy.</a> Curr Protoc. 3 (8), e842(2023).</li>
<li>Hickey, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy-An+outline+of+hardware%2C+biological+handling%2C+and+fluorophore+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy-An outline of hardware, biological handling, and fluorophore considerations.</a> Cells. 11 (1), 35(2021).</li>
<li>Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-drop+anesthesia+for+small+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Can+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Open-drop anesthesia for small laboratory animals.</a> Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).</li>
<li>Bodnar, M. J., Ratuski, A. S., Weary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+isoflurane+anesthesia+using+the+drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Mouse isoflurane anesthesia using the drop method.</a> Lab Anim. 57 (6), 623-630 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>18 G, 1 1/2 ago (305185)</td><td>Fisher</td><td>305185</td><td></td></tr><tr><td>1 L&nbsp; Barattolo con tappo a vite&nbsp; (Nalgene)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-823-33</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe non sterili sfuse Air-Tite 10 mL Luer Lock</td><td>Fisher</td><td>14-817-175</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed Injection (soluzione sterile di xilazina)</td><td>Akorn</td><td>59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Bloccante e diluente senza animali, R.T.U.</td><td>Vector</td><td>SP-5035-100</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard Catetere IV schermato alato con catetere BD Vialon Materiale 18 G x 1,88 in</td><td>BD</td><td>381547</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&trade;)</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Arancione CMRA Colorante</td><td>Fisher Scientific NC0873640</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Labviva</td><td>75003</td><td></td></tr><tr><td>Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3&Delta; &nbsp;</td><td>BEI Resources</td><td>NR-166</td><td></td></tr><tr><td>Filtri Corning da 70 micron</td><td>VWR</td><td>10054-456</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM AlexaFluor647 anticorpo monoclonale</td><td>Biolegend</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Aghi HYpodermic 30 G x 1/2"</td><td>Labviva</td><td>EN3012</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Siringhe sterili monouso (1mL, Leur Slip)</td><td>Fisher</td><td>14-955-462</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio Monoidrato</td><td>Azer Scientific&nbsp;</td><td>ES17530-500G</td><td></td></tr><tr><td>Grasso per alto vuoto</td><td>VWR</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Soluzione 20 mM (5 mL)</td><td>ThermoFischer</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano USP</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina cloridrato</td><td>Dechra</td><td>1000001250</td><td></td></tr><tr><td>KIMWIPES Tergicristalli per attività delicate (4,4'' x 8,4")</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Lexer Forbici per bambini</td><td>FST</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Micro-Adson</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Formalina tamponata neutra (10%) (Azer Scientific)</td><td>Fisher</td><td>22-026-350</td><td></td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask fiaschette per coltura tissutale, T75, tappi filtro</td><td>VWR</td><td>15708-134</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way stampi per inclusione</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>QuPath 0.5.1 Software</td><td>Open-source</td><td>https://qupath.github.io/</td><td></td></tr> <tr><td>Filo di sutura in seta misura 3/0</td><td>FST</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>VetriniMicro vetrini Superfrost Plus&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant (2 mL)</td><td>ThermoFischer</td><td>S36917</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ThermoFischer</td><td>J20605. </td><td></td>AP</tr><tr><td>Vector Laboratories Set di 2</td> occhiali <td>Fisher Scientific</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Cover, rettangolari (24 mm x 40 mm #1,5)</td><td>VWR</td><td>48393-230</td><td></td></tr><tr><td>Rete metallica in plastica bianca</td><td>MAPORCH</td><td>789862904922</td><td></td></tr><tr><td>estratto di lievito</td><td>Fisher</td><td>BP9727-500</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioScan 7&nbsp;</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html</td><td>microscopio fluorescente multicanale</td></tr><tr><td>ZEN 3.7 Software</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html</td><td>software per microscopia</td></tr></tbody></table>

metodo efficiente per l'imaging dei polmoni murini che preserva la dinamica spaziale delle spore fungine nelle vie aeree

Efficient Method for Imaging Murine Lungs that Preserves Spatial Dynamics of Fungal Spores in the Airways

Questo metodo produce infine immagini immunofluorescenti dei polmoni di topo utilizzando il gonfiaggio fisiologico dell'aria per lasciare indisturbate le vie aeree. È importante sottolineare che più punti di controllo lungo il percorso confermeranno che i componenti del protocollo sono stati eseguiti correttamente. Durante l'inoculazione, è importante confermare che l'inoculo sia stato aspirato sentendo la presenza di "crepitii" sulla parete toracica posteriore del topo che indicano che il liquido è entrato nelle vie aeree. Se non c'è sensazione di crepitii, è possibile che il topo abbia ingoiato l'inoculo. La perfusione dei polmoni di topo con PBS dovrebbe provocare una screziatura bianca dei polmoni seguita da uno sbiancamento completo dell'intero polmone (Figura 2A). In caso di sbiancamento incompleto, la successiva perfusione di formalina non raggiungerà tutte le aree del parenchima polmonare (Figura 2B). Quando si gonfia il polmone con aria, i polmoni devono distendersi lentamente fino a raggiungere le dimensioni fisiologiche. Dopo aver legato la sutura tracheale per fissare l'aria all'interno dei polmoni, i polmoni non devono contrarsi di dimensioni. Se lo fanno, è probabile che il polmone sia stato perforato durante la procedura.
Qui, mostriamo immagini rappresentative di sezioni con spore marcate di Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ (verde) e epitelio bronchiolare colonnare EpCAM+ (magenta) sia nei polmoni gonfiati ad aria che in quelli gonfiati a liquido in formalina (Figura 3A, B rispettivamente). Queste spore si accumulano principalmente all'interno dei bronchioli distali e negli spazi alveolari immediatamente adiacenti a quei bronchioli distali, probabilmente nei dotti alveolari. I polmoni gonfiati ad aria con fissativo perfuso contengono spore che compaiono più frequentemente all'interno dei bronchioli e si raggruppano più vicino ai bronchioli (Figura 3A), piuttosto che il fissativo liquido dove le spore appaiono leggermente più disperse dall'epitelio bronchiolare (Figura 3B). Attraverso l'analisi spaziale QuPath, misuriamo la distanza delle singole spore dall'epitelio bronchiolare EpCAM+ più vicino per indicare il livello di dispersione delle spore lontano dal bronchiolo e negli spazi alveolari più distali. Mostriamo che l'inflazione liquida disperde le spore più lontano dai bronchioli rispetto all'inflazione fisiologica dell'aria (Figura 4A, B). La perfusione vascolare ad aria preserva il posizionamento naturale di queste spore nei bronchioli distali e previene la dispersione artificiale di queste spore negli spazi alveolari più distali mediante instillazione fissativa intratracheale.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig02.jpg"> 
Figura 2: Indicazione del successo della perfusione polmonare. (A) I polmoni perfusi con successo saranno completamente bianchi. (B) I polmoni non completamente perfusi appariranno rosa o screziati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig03.jpg"> 
Figura 3: Immagini rappresentative della distribuzione delle spore nei polmoni perfusi in formalina gonfiati ad aria rispetto ai polmoni gonfiati in formalina. Si è visto che le spore fluorescenti intracellulari (verde) sono distribuite più vicino all'epitelio bronchiolare EpCAM+ (magenta) nei polmoni (A) gonfiati ad aria rispetto ai polmoni (B) gonfiati in formalina. Le immagini sono state ottenute da sezioni con una profondità di 1,2 mm dalla superficie posteriore dei lobi sinistri dei topi in ciascun gruppo di trattamento su un microscopio fluorescente multicanale con ingrandimento 20x e le piastrelle sono state cucite utilizzando un software di microscopia. Barra di scala = 800 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig04.jpg"> 
Figura 4: Confronto della distanza delle spore (mm) dall'epitelio bronchiolare tra polmoni gonfiati ad aria e polmoni trattati con spore gonfiate in formalina. I polmoni di 3 topi per gruppo di trattamento sono stati raccolti, elaborati e sottoposti a imaging per 1,5 ore dopo l'inoculazione con 1 x 106 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. Quattro sezioni per topo sono state campionate a 0,8 mm, 1,2 mm, 1,6 mm e 2,0 mm dalla superficie posteriore del lobo sinistro, colorate e visualizzate su un microscopio fluorescente multicanale. Tutte le spore di ciascun gruppo sono state rilevate e analizzate spazialmente in QuPath per determinare la (A) distanza dall'epitelio bronchiolare colonnare EpCAM+ più vicino e (B) la mediana e gli intervalli di confidenza al 95% sono visualizzati in unità di micrometri. Spore di gonfiaggio atmosferico, n = 11.673. Spore di inflazione liquida, n = 9,837. Il t-test di Mann-Whitney è stato eseguito a causa della mancanza di normalità e p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Metodo efficiente per l'imaging dei polmoni murini che preserva la dinamica spaziale delle spore fungine nelle vie aeree

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and ...

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Immunologia e Infezioni

Mostriamo, come utilizzare 2-fotoni microscopia per l'osservazione delle dinamiche di granulociti neutrofili nei polmoni infettati mentre fagocitare agenti patogeni o di produrre dei neutrofili trappole extracellulare (NET).

Osservazione diretta di fagocitosi e NET-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni Microscopia

Questo video descrive un metodo di preparazione dei polmoni per l'imaging dal vivo ex vivo per studiare le interazioni tra cellule tumorali e cellule stromali, utilizzando l'agarosio per l'inflazione. Nel protocollo del campione, la procedura di inflazione dell'agarosio viene descritta prima di osservare le interazioni cellulari vive.

Inflazione dell'agarosio polmonare intero: un metodo per preparare i polmoni per l'imaging dal vivo ex vivo

Descriviamo un metodo relativamente semplice per ex vivo l'imaging dal vivo del tumore interazioni cellula-stroma all'interno di metastasi polmonari, utilizzando i reporter fluorescenti nei topi. Utilizzando la microscopia confocale spinning-disk, questa tecnica consente la visualizzazione di cellule vive per almeno 4 ore e potrebbe essere adattato per studiare altre malattie polmonari infiammatorie.

Ex vivo dal vivo Imaging di polmone metastasi e il loro micro

Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multifotone per eseguire l'imaging a lungo termine ad alta risoluzione di una singola cellula del polmone intatto in tempo reale utilizzando una finestra di imaging stabilizzata sotto vuoto.

A lungo termine ad alta risoluzione intravitale Microscopia nel polmone con un vuoto stabilizzato finestra Imaging

Descriviamo un multimodali non invasive imaging approccio basato su Micro-CT e fluorescenza molecolare tomografia per valutazione longitudinale del modello di fibrosi del polmone del topo indotto mediante instillazione intratracheale doppia di bleomicina.

Un Multimodal Imaging approccio basato su Micro-CT e fluorescenza molecolare tomografia per valutazione longitudinale della fibrosi polmonare indotta da bleomicina in topi

Descriviamo l'imaging ottico dei topi infettati con la tubercolosi del micobatterio (M. tuberculosis) usando la fluorescenza di enzima reporter (REF). Questo protocollo facilita la rilevazione sensibile e specifica di M. tuberculosis in modelli animali preclinici per la ricerca di patogenesi, terapeutica e vaccino.

Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

Qui descriviamo un protocollo per determinare l'onere fungine polmonari nei topi con aspergillosi invasiva mediante la quantificazione di argento methanamine modificate di Gomori colorazione nelle sezioni istologiche. Utilizzo di questo metodo ha provocato risultati comparabili con meno animali rispetto alla valutazione dell'onere fungine mediante PCR quantitativa di DNA fungoso del polmone.

Istologico quantificazione per determinare il fardello fungine del polmone nell'aspergillosi sperimentale

In questo studio, presentiamo un protocollo per eseguire due-fotone videomicroscopia imaging e cella analisi di interazione nella mucosa trachea murino dopo infezione con virus dell'influenza. Questo protocollo sarà rilevante per i ricercatori che studiano la dinamica delle cellule immuni durante le infezioni respiratorie.

La formazione immagine interazione cellula nella Mucosa trachea durante l'infezione da Virus influenzale usando la microscopia Intravital due-fotone

In questa pubblicazione descriviamo protocolli per la valutazione del gioco mucociliare delle vie aeree (MCC) nei topi in vivo utilizzando l'imaging a radionuclide a doppia modalità. Questo protocollo è progettato per una singola tomografia computerizzata ad emissione di fotoni (SPECT) e un protocollo di acquisizione della tomografia computerizzata (CT) utilizzando collimatori a tutto il corpo del mouse (MWB) in un doppio sistema SPECT/CT.

Valutazione in vivo del nulla osta mucociliario nei topi

Descriviamo il metodo per l'analisi quantitativa della distribuzione di Aspergillus fumigatus conidia (3 μm di dimensione) nelle vie aeree dei topi. Il metodo può anche essere utilizzato per l'analisi della distribuzione di microparticelle e agglomerato di nanoparticelle nelle vie aeree in vari modelli di condizioni patologiche.

Analisi quantitativa basata su microscopia a scansione laser confocale della distribuzione di conidi di Aspergillus fumigatus nel polmone di topo a montaggio intero otticamente cancellato

Qui presentiamo un protocollo per l'imaging intravitale di Mycobacterium tuberculosis approvato BSL-2 attenuato. Ceppo nel polmone murino utilizzando una finestra polmonare permanente. Questo approccio consente un'analisi longitudinale a risoluzione monocellulare delle prime interazioni ospite-patogeno, inclusa localizzazione bacillare, dinamica vascolare e assorbimento di macrofagi nello stesso microambiente polmonare.

Imaging intravitale dell'attenuazione dell'Auxotrophic Mycobacterium tuberculosis nel polmone murino durante l'infezione intravascolare precoce

Scopri un metodo efficiente per l'imaging dei polmoni murini che preserva la posizione naturale delle spore fungine nelle vie aeree. Questo protocollo consente l'analisi dettagliata tramite microscopia a fluorescenza per studiare la patogenesi fungina.

Metodo efficiente per l'imaging dei polmoni murini che preserva la dinamica spaziale delle spore fungine nelle vie aeree

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