Name: Lavaggio salino per il campionamento del microambiente immunitario nasale canino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: Scopri la tecnica di lavaggio nasale salino per campionare il microambiente immunitario canino in modo non invasivo. Questo metodo consente analisi seriali delle risposte immunitarie nei tumori nasali.

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<ol><li>Cohn, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+nasal+disease%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin%3A+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Canine nasal disease: An update.</a> Vet Clin: Small Anim Pract. 50 (2), 359-374 (2020).</li>
<li>Mortier, J., Blackwood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+nasal+tumours+in+dogs%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Treatment of nasal tumours in dogs: A review.</a> J Small Anim Pract. 61 (7), 404-415 (2020).</li>
<li>Plickert, H., Tichy, A., Hirt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+canine+nasal+discharge+related+to+intranasal+diseases%3A+A+retrospective+study+of+105+cases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Characteristics of canine nasal discharge related to intranasal diseases: A retrospective study of 105 cases.</a> J Small Anim Pract. 55 (3), 145-152 (2014).</li>
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<li>Van Pelt, D. R., Mckiernan, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+treatment+of+canine+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and treatment of canine rhinitis.</a> Vet Clin North Am Small Anim Pract. 24 (5), 789-806 (1994).</li>
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<li>Ashbaugh, E. A., Mckiernan, B. C., Miller, C. J., Powers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+hydropulsion%3A+A+novel+tumor+biopsy+technique%5BTitle%5D)+AND+%22JAAHA%22%5BJournal%5D)">Nasal hydropulsion: A novel tumor biopsy technique.</a> JAAHA. 47 (5), 312-316 (2011).</li>
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<li>Darragh, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elective+nodal+irradiation+mitigates+local+and+systemic+immunity+generated+by+combination+radiation+and+immunotherapy+in+head+and+neck+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Elective nodal irradiation mitigates local and systemic immunity generated by combination radiation and immunotherapy in head and neck tumors.</a> Nat Commun. 13 (1), 7015(2022).</li>
<li>Pinard, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lymphocyte-specific+programmed+cell+death+protein+1+receptor+expression+and+cytokines+in+blood+and+urine+in+canine+urothelial+carcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Comp+Oncol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lymphocyte-specific programmed cell death protein 1 receptor expression and cytokines in blood and urine in canine urothelial carcinoma patients.</a> Vet Comp Oncol. 20 (2), 427-436 (2022).</li>
<li>Choi, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+canine+pd-1%2Fpd-l1+specific+monoclonal+antibodies+and+amplification+of+canine+t+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of canine pd-1/pd-l1 specific monoclonal antibodies and amplification of canine t cell function.</a> PLoS One. 15 (7), e0235518(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 ml&nbsp; Tubi</td><td>Eppendorf</td><td>05-402</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Pipetta</td><td>VWR</td><td>89079-974</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe da 20 mL VWR</td><td></td><td>BD302830</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Provette coniche</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>70 &; m Filtro cellulare</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Catetere sterile in gomma rossa 8FR</td><td>Med Vet International</td><td>50-252-2428</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lisi Tampone</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Beckman</td><td>Coulter</td><td>366816</td><td></td></tr><tr><td>fisiologica (0,9%)</td><td>Vetivex</td><td>17033-492-01</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>Codice 10153-838</td><td></td></tr></tbody></table>

lavaggio salino per il campionamento del microambiente immunitario nasale canino

Saline Lavage for Sampling of the Canine Nasal Immune Microenvironment

Con questo metodo di lavaggio nasale, il campione raccolto apparirà leggermente torbido, possibilmente con pezzi visibili di detriti cellulari e muco quando il tubo viene fatto roteare. Un campione sarebbe considerato contaminato da sangue periferico se la procedura di lavaggio induce inavvertitamente sanguinamento e il campione si tinge di rosso. Mentre una parte della soluzione salina infusa andrà persa durante la procedura, si prenderebbe in considerazione un lavaggio negativo se la soluzione salina infusa non rifluisce dalla narice e nel tubo; Le potenziali cause potrebbero essere che la testa non è sufficientemente inclinata verso il basso per consentire un efficace riflusso, il campione è stato drenato caudalmente o lateralmente attraverso la narice controlaterale o il catetere di gomma rossa non è fissato saldamente alla siringa e la soluzione salina è fuoriuscita dal punto di connessione.
Quando i campioni di lavaggio nasale sono stati raccolti con successo da cani con cancro nasale, si prevede una conta delle cellule nucleate nell'intervallo di 1 × 10 6-200 × 106, con il 75-96% di cellule vive. In alternativa, quando i campioni di lavaggio nasale sono stati raccolti con successo da cani con cavità nasali altrimenti sane e non infiammate, la conta delle cellule è stata compresa tra 7 × 105-2 × 106, con il 6-16% di cellule vive. Un'immagine rappresentativa di campioni citologici ottenuti dal campionamento di lavaggio nasale di cani portatori di tumore è presentata nella Figura 2. Inoltre, nella Figura 3 viene presentata la valutazione citofluorimetrica delle popolazioni cellulari analizzate da campioni di lavaggio nasale di cani sani e portatori di tumore. Ci si aspetterebbe che la conta cellulare e la percentuale di vitalità inferiori a questi intervalli indichino che la procedura di lavaggio nasale e la raccolta del campione non hanno avuto successo. La Tabella 1 riassume i risultati della tecnica di lavaggio nasale eseguita dagli autori rispetto al numero di procedure eseguite, al numero di cani, alle condizioni della cavità nasale (sana o portatrice di tumore), alla resa della conta delle cellule nucleate, alla vitalità delle cellule ottenute per la procedura e al fatto che il campione di lavaggio sia stato considerato un successo o un fallimento per l'analisi a valle. Ai fini degli esperimenti eseguiti con i campioni di lavaggio nasale inclusi nella Tabella 1, una resa minima del numero di cellule di 150.000 è stata considerata una raccolta di campioni di lavaggio nasale di successo.
Con questa tecnica di lavaggio nasale, viene utilizzata soluzione fisiologica sterile allo 0,9% per raccogliere le cellule. In alternativa, si potrebbe prendere in considerazione la soluzione di Hartmann (soluzione di Ringer lattato); tuttavia, i campioni raccolti con soluzione salina o con la soluzione di Hartmann dovrebbero essere testati per garantire una vitalità e risultati comparabili per le cellule di interesse. Inoltre, un'alternativa all'uso di un catetere di gomma rossa nei cani non portatori di tumore potrebbe essere quella di eseguire il lavaggio nasale con un catetere di Foley. Sebbene non sia utilizzato nella tecnica di lavaggio nasale qui presentata, l'uso di un catetere di Foley consentirebbe il gonfiaggio del palloncino sulla punta del catetere, occludendo la cavità nasale e prevenendo la perdita di liquido caudalmente. Inoltre, sebbene non sia stato testato nell'approccio di elaborazione del lavaggio nasale qui presentato, l'aggiunta di ialuronidasi al campione di lavaggio nasale potrebbe essere considerata per rompere il muco raccolto nel campione di lavaggio nasale e liberare più cellule per l'analisi. Anche questo dovrebbe essere ottimizzato per garantire che i risultati non vengano alterati dall'aggiunta di ialuronidasi alla procedura di elaborazione del lavaggio nasale.
I risultati pubblicati ottenuti da procedure di lavaggio nasale eseguite con successo in cani arruolati in uno studio clinico sul cancro canino sono presentati nella Figura 310. I risultati presentati nella Figura 3 provengono da uno studio che indaga l'impatto dell'irradiazione linfonodale elettiva sul microambiente immunitario locale di cani con tumori sinonasali i cui tumori sono stati irradiati da soli o in combinazione con l'irradiazione regionale dei linfonodi cervicali. Attraverso il campionamento seriale della cavità nasale dei cani nello studio clinico con lavaggio nasale, l'analisi citofluorimetrica delle cellule raccolte ha rivelato una diminuzione significativa delle popolazioni di cellule T effettrici l'ultimo giorno di radioterapia quando i linfonodi regionali sono stati irradiati in concomitanza con il tumore sinonasale rispetto ai cani che hanno ricevuto radioterapia mirata al tumore e i linfonodi regionali sono stati risparmiati. Ciò dimostra l'utilità del campionamento seriale della cavità nasale con il lavaggio per studiare i cambiamenti nelle popolazioni cellulari in diversi punti e con diverse condizioni di trattamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig01.jpg"> 
Figura 1: Schema del metodo di lavaggio nasale. La soluzione salina sterile riscaldata viene infusa nella cavità nasale dei cani anestetizzati utilizzando un catetere di gomma rossa. Il liquido di lavaggio nasale viene raccolto in un tubo mentre fuoriesce dal naso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig02.jpg"> 
Figura 2: Composizione cellulare di un campione di lavaggio nasale raccolto da un cane con un tumore nasale. Immagine rappresentativa di campioni citologici ottenuti da campionamento di lavaggio nasale (ingrandimento 500x, colorazione di Wright-Giemsa modificata). I neutrofili (frecce) sono le cellule predominanti, con la presenza anche di alcune cellule epiteliali squamose (punta di freccia) e piccoli linfociti maturi (evidenziati nel riquadro quadrato). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig3v2.jpg"> 
Figura 3. Analisi citofluorimetrica di campioni di lavaggio nasale prelevati da cani sani e portatori di tumore. Confronto dell'abbondanza di cellule vive, cellule immunitarie e neutrofili tra cani sani (blu, n = 3) e cani portatori di tumore con carcinoma sinonasale (rosso, n = 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig3v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig04.jpg"> 
Figura 4: Analisi citofluorimetrica di cellule raccolte dal lavaggio nasale da cani arruolati in uno studio clinico che indaga l'impatto dell'irradiazione linfonodale elettiva (ENI) sul microambiente immunitario locale. Quantificazione delle cellule T CD4 (CD5+CD4+) e CD8 (CD5+CD8+) da campioni di lavaggio nasale. I cani trattati con ENI in concomitanza con l'irradiazione tumorale (n = 3) avevano cellule T effettrici CD4 e CD8 significativamente ridotte nell'ultimo giorno di radioterapia (Giorno 3) rispetto ai cani trattati con radiazioni mirate al solo tumore (n = 3). Questa cifra è stata modificata da Darragh et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Integro (n=3)</td>
			<td>Cuscinetto tumorale (n= 19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Numero di procedure eseguite</td>
			<td>3</td>
			<td>80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conteggio delle celle</td>
			<td>0,7 x 106 - 2,8 x 106</td>
			<td>1,6 x 106 - 210 x 106; mediana: 8,7 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitalità cellulare</td>
			<td>6.3 - 15.9%</td>
			<td>75% - 96%; mediana: 87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percentuale di successo</td>
			<td>100%</td>
			<td>98.80%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Riepilogo delle procedure di lavaggio nasale eseguite e delle caratteristiche cellulari dei campioni ottenuti.

Lavaggio salino per il campionamento del microambiente immunitario nasale canino

Evaluating the local immune microenvironment of the canine nasal cavity can be important for investigating normal tissue health and disease conditions, ...

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