Name: Valutazione della glutammina come fonte di combustibile per macrofagi alveolari esposti a etanolo cronico utilizzando un bioanalizzatore di flusso extracellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Scopri come la glutammina funge da fonte energetica per i macrofagi alveolari esposti a etanolo cronico utilizzando un bioanalizzatore di flusso extracellulare. Questo metodo consente misurazioni in tempo reale della respirazione mitocondriale.

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<meta charset="utf8"></head><body>L'etanolo compromette la bioenergetica AM passando alla respirazione glutammina-dipendente

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Provetta conica da 15 mL</td><td>VWR International, Inc.</td><td>21008-670</td><td>Utilizzato per la preparazione di concentrazioni stock di reagenti correlati ai mitocondri.</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>M6250</td><td>Utilizzato per la coltura di cellule MH-S.</td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>Dot Scientific, Inc.</td><td>70-1180</td><td>Utilizzato per raschiare le celle MH-S dai palloni T-75.</td></tr><tr><td>Countess 3 FL Strumento: contatore di celle</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>AMQAF2000</td><td>Utilizzato per contare il numero di cellule MH-S da placcare per esperimenti.</td></tr><tr><td>D-glucosio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>G8270</td><td>Utilizzato per il mezzo base del flusso extracellulare.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>4355720</td><td>Trattamento sperimentale per cellule MH-S.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sciencell Research Laboratories</td><td>500</td><td>Utilizzato per la coltura di cellule MH-S.</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>G1397</td><td>Utilizzato per la coltura di cellule MH-S.</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Utilizzato per il mezzo base del flusso extracellulare.</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.2.3</td><td>GraphPad Software</td><td>N/A</td><td>Software per l'analisi statistica. Scaricabile dopo l'acquisto presso https://www.graphpad.com/features.</td></tr><tr><td>Cellule MH-S</td><td>Collezione di colture di tipo americano</td><td>CRL-2019</td><td>Linea cellulare di macrofagi alveolari di topo.</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga&nbsp;</td><td>Stati Uniti Scientifici, Inc.</td><td>4036-3212</td><td>Utilizzato per la preparazione di concentrazioni di lavoro di reagenti correlati ai mitocondri.</td></tr><tr><td>Microsoft 365 Excel: programma per fogli di calcolo Microsoft</td><td></td><td>N/A</td><td>Software per l'organizzazione dei dati e i calcoli bioenergetici mitocondriali. Scaricabile dopo l'acquisto su https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel.</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>15140122</td><td>Utilizzato per la coltura di cellule MH-S.</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>VWR International, Inc.</td><td>45000-446</td><td>Utilizzato per il lavaggio delle celle MH-S.</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>VWR Internazionale, Inc.</td><td>45000-396</td><td>Utilizzato per la coltura di cellule MH-S.</td></tr><tr><td>Seahorse Wave Pro Software: programma software per la progettazione e l'analisi di saggi</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>N/A</td><td>Il computer è collegato allo strumento Seahorse XF Pro Analyzer. Scaricabile da&nbsp; https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium: terreno base a flusso extracellulare, pH 7.4</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>103334-100</td><td>Utilizzato per la preparazione di concentrazioni di riserva e di lavoro di reagenti correlati ai mitocondri e per la coltura di cellule MH-S prima delle prove sperimentali.</td></tr><tr><td>Kit per test da stress di ossidazione della glutammina Seahorse XF</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>103674-100</td><td>Contiene BPTES di serie, oligomicina, FCCP e rotenone/antimicina A.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Pro Analyzer: bioanalizzatore di flusso extracellulare</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>N/A</td><td>Bioanalizzatore di flusso extracellulare.</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak: cartucce per flux pak extracellulari a 96 pozzetti, piastre per microcoltura a flussante extracellulare a 96 pozzetti e soluzione calibrante</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>102416-100</td><td>Utilizzato per preparare le cellule MH-S per i saggi utilizzando un bioanalizzatore di flusso extracellulare.</td></tr><tr><td>Pipetta sierologica&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotecnologia, Inc.</td><td>sc-550678</td><td>Utilizzato per la rimozione di terreni dalle celle MH-S.</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>S6014</td><td>Utilizzato per la coltura di cellule MH-S.</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>P4562</td><td>Utilizzato per il mezzo base del flusso extracellulare.</td></tr><tr><td>Palloni T-75</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-200263</td><td>Utilizzato per la coltura di cellule MH-S.</td></tr></tbody></table>

valutazione della glutammina come fonte di combustibile per macrofagi alveolari esposti a etanolo cronico utilizzando un bioanalizzatore di flusso extracellulare

Assessment of Glutamine as a Fuel Source for Alveolar Macrophages Exposed to Chronic Ethanol Using an Extracellular Flux Bioanalyzer

L'esposizione cronica all'EtOH riduce la dipendenza dalla glutammina nelle cellule MH-S. La glutamminolisi è una via fondamentale per la respirazione mitocondriale, supportando la glutammina come importante fonte di carburante per la bioenergetica cellulare. Per determinare se l'esposizione cronica all'EtOH altera la dipendenza delle cellule MH-S dalla glutammina come fonte di carburante per la respirazione mitocondriale, le cellule MH-S sono state trattate senza controllo EtOH (Con) o EtOH e l'OCR è stato misurato nel tempo in risposta a iniezioni seriali di reagenti associati alla respirazione mitocondriale. I profili bioenergetici OCR in risposta a iniezioni seriali di oligomicina (inibitore dell'ATP sintasi), FCCP (disaccoppiatore di protoni) e R/A (rispettivamente inibitori del complesso mitocondriale I e del complesso III) vengono utilizzati per calcolare altri parametri della bioenergetica mitocondriale, come la respirazione legata all'ATP, la respirazione massimale e la capacità respiratoria di riserva. Tutti i dati mostrati sono repliche biologiche aggiuntive di gruppi sperimentali di cellule MH-S Con + media, Con + BPTES e EtOH + media, EtOH + BPTES MH-S che sono stati pubblicati in Crotty et al.11. Come mostrato nella Figura 2A, l'oligomicina ha diminuito l'OCR a causa dell'inibizione del complesso V, l'FCCP ha aumentato l'OCR a causa del disaccoppiamento mitocondriale del potenziale di membrana e della generazione12 di ATP dipendente dai mitocondri e l'R/A ha spento efficacemente l'OCR dipendente dai mitocondri. Questi profili delle risposte bioenergetiche OCR alle iniezioni seriali sono coerenti con la guida per l'utente per la valutazione dello stress mitocondriale utilizzando un bioanalizzatore di flusso extracellulare13,14.
Dopo che l'OCR basale è stato misurato in cellule MH-S trattate con Con- ed EtOH, è stata caricata un'iniezione di controllo dei terreni o BPTES, un inibitore della glutaminasi 1. Le cellule Con + terreni rispetto alle cellule Con + BPTES MH-S e i terreni EtOH + rispetto alle cellule EtOH + BPTES MH-S non hanno dimostrato differenze nei profili bioenergetici OCR (Figura 2A). Le cellule MH-S EtOH + BPTES hanno mostrato una diminuzione della respirazione basale glutammina-dipendente rispetto a Con + BPTES (misura #4 rispetto alla misura #3 nella Figura 2A e nella Figura 2B), suggerendo che l'EtOH diminuisce l'ossidazione basale della glutammina delle cellule MH-S contribuendo alla respirazione mitocondriale. Le cellule MH-S EtOH + BPTES hanno mostrato una perdita di respirazione mitocondriale legata alla glutammina ATP rispetto a Con + BPTES (Figura 2C). Sebbene le cellule MH-S EtOH + BPTES abbiano dimostrato una perdita attenuata nella respirazione massima glutammina-dipendente rispetto a Con + BPTES (Figura 2D), le cellule MH-S EtOH + BPTES hanno mostrato una diminuzione della capacità respiratoria di riserva glutammina-dipendente rispetto a Con + BPTES (Figura 2E). Questi risultati suggeriscono che le cellule EtOH MH-S hanno la capacità di essere più dipendenti dalla glutammina per la respirazione, come quando stressate con FCCP, ma che potrebbero non essere in grado di farlo a causa di un aumento della domanda di glutammina compensato da una diminuzione della biodisponibilità della glutammina.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67579/67579fig01.jpg"> 
Figura 1: Panoramica generale del flusso di lavoro per la misurazione della respirazione mitocondriale glutammina-dipendente e della bioenergetica nelle cellule MH-S, una linea cellulare di macrofagi alveolari di topo. Monostrati di cellule MH-S coltivate in pozzetti su piastra per microcoltura a flusso extracellulare (fase 3.1) sono stati incubati con terreno base di flusso extracellulare con l'aggiunta di integratori (fase 3.2) a 37°C in un incubatore umidificato senza CO2 per 30 min-1 h (fase 3.4). Il terreno base del flusso extracellulare con l'aggiunta di integratori (fase 3.2) è stato utilizzato come mezzo di controllo e per diluire le concentrazioni di lavoro dell'inibitore dell'ossidazione della glutammina BPTES alla concentrazione finale di 3 μM, l'inibitore del complesso mitocondriale V oligomicina (Oligo) alla concentrazione finale di 0,5 μM, l'uncoupler mitocondriale carbonil cianuro-p-trifluorometossifenilidrazone (FCCP) alla concentrazione finale di 0,5 μM e gli inibitori del complesso mitocondriale I e del complesso III rotenone/antimicina A (R/A) a 0,5 μM concentrazione finale per le bocche di caricamento A-D nella cartuccia PAK a flusso extracellulare superiore (passaggio 3.7). La strategia di iniezione per i tempi di miscelazione, attesa e misurazione per l'esecuzione sperimentale utilizzando il bioanalizzatore di flusso extracellulare è stata: 3 minuti di tempo di miscelazione, 0 minuti di attesa e 6 misurazioni di 3 minuti di misurazione per la porta A (controllo dei media o BPTES); 3 minuti di tempo di miscelazione, 0 minuti di attesa e 3 misurazioni di 3 minuti di tempo di misura per la porta B (Oligo); 3 minuti di miscelazione, 6 minuti di attesa e 3 misurazioni di 3 minuti per la porta C (FCCP); e 3 minuti di miscelazione, 0 minuti di attesa e 3 misurazioni di 3 minuti di misurazione per la porta D (R/A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67579/67579fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67579/67579fig02.jpg"> 
Figura 2: L'etanolo cronico (EtOH) riduce la respirazione mitocondriale glutammina-dipendente nelle cellule MH-S, una linea cellulare di macrofagi alveolari di topo. Le cellule MH-S non sono state trattate (Con) o trattate con EtOH (0,08%, 72 ore) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) nel tempo è stato misurato utilizzando un bioanalizzatore di flusso extracellulare prima e dopo l'iniezione con controllo dei terreni o un inibitore dell'ossidazione della glutammina (GLN) (3 μM di BPTES), seguito da iniezioni seriali di inibitore del complesso V mitocondriale (0,5 μM di oligomicina, Oligo), disaccoppiatore mitocondriale (0,5 μM di cianuro di carbonile-p-trifluorometossifenilidrazone, FCCP) e inibitori del complesso mitocondriale I e del complesso III (0,5 μM di rotenone/0,5 μM di antimicina A, R/A). (A) I profili bioenergetici OCR sono stati utilizzati per calcolare la respirazione basale glutammina-dipendente, (C) la respirazione legata all'ATP, (D) la respirazione massimale e (E) la capacità respiratoria di riserva. I punti lineari rappresentano le medie ± SEM (n = 4, #p &lt; 0,05 rispetto a Con + media e *p &lt; 0,05 rispetto a Con + BPTES, ANOVA unidirezionale con post hoc di Tukey). Le barre rappresentano le medie ± SEM (n = 4, *p &lt; 0,05 rispetto a Con + BPTES, t-test di Student). I dati presentati sono repliche biologiche aggiuntive per i gruppi sperimentali di controllo dei terreni e trattati con BPTES di cellule MH-S di controllo non trattate e esposte croniche a EtOH, che sono pubblicate in Crotty et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67579/67579fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Valutazione della glutammina come fonte di combustibile per macrofagi alveolari esposti a etanolo cronico utilizzando un bioanalizzatore di flusso extracellulare

Alveolar macrophages (AMs) are the first line of cellular defense in the lower airway against pathogens. However, chronic and excessive alcohol use ...

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Stabile mediante l'analisi isotopica profilazione di massa gas-cromatografia spettrometria di flusso intermediario metabolica è descritto nel...

Stabile Profiling isotopica di Flux Intermediario Metabolica in fase di sviluppo e per adulti Caenorhabditis elegans</em

Questo protocollo fornisce un approccio biochimico per misurare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) delle cellule leucemiche primarie con saggio del flusso extracellulare. La valutazione del profilo metabolico di queste cellule aiuta a caratterizzare le loro richieste, portando a una terapia personalizzata.

Saggio del flusso extracellulare: un metodo per misurare il profilo metabolico delle cellule

Una descrizione di come calibrare trasferimento Förster Resonance Energy sensori biologici integrati (FIBS) per in situ profilo metabolico è presentato. Le FIBS possono essere utilizzati per misurare i livelli intracellulari di metaboliti non invasivo aiutando nello sviluppo di modelli metabolici e high throughput screening delle condizioni bioprocesso.

FIBS-enabled non invasiva Metabolic Profiling

La riprogrammazione metabolica è una caratteristica e un prerequisito per la polarizzazione dei macrofagi M1 e M2. Questo manoscritto descrive un test per la misurazione dei parametri fondamentali della glicolisi e della funzione mitocondriale nei macrofagi derivati dal midollo osseo di topo. Questo strumento può essere applicato per studiare come particolari fattori influenzano il metabolismo e il fenotipo del macrofago.

Caratterizzazione metabolica di Polarized M1 e M2 macrofagi derivate dal midollo osseo Utilizzando analisi in tempo reale extracellulare Flux

La glicolisi è un marcatore metabolico determinante in molteplici sistemi biologici. Il monitoraggio della glicolisi misurando il flusso extracellulare di H+ è comune, ma richiede una correzione quantitativa e inequivocabile. Qui, dimostriamo come raccogliere e correggere i dati del flusso extracellulare per distinguere tra fonti respiratorie e glicolitiche di acidificazione extracellulare.

Misura e Analisi di extracellulare Acido prodotte per determinare glicolitica Tasso

Qui, presentiamo un protocollo graduale per studiare la respirazione mitocondriale e la funzione glicolitica in Candida Albicans utilizzando un analizzatore di flusso supplementare.

Indagine di bio-energetica di Candida albicans utilizzando extracellulare Flux analisi Real-Time

I protocolli descrivono metodi di cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiati all'indice di rifrazione o al rilevamento spettrometrico di massa per lo studio delle reazioni metaboliche in complessi sistemi privi di cellule a base di lisato.

Cromatografia liquida accoppiata all'indice di rifrazione o al rilevamento spettrometrico di massa per la profilazione dei metaboliti in sistemi privi di cellule a base di lisato

Il saggio del flusso metabolico cellulare in tempo reale misura il tasso di consumo di ossigeno e il tasso di acidificazione extracellulare, che corrisponde alla produzione di adenosina trifosfato mitocondriale e glicolitica, utilizzando sensori di pH e ossigeno. Il manoscritto spiega un metodo per comprendere lo stato energetico degli osteoblasti e la caratterizzazione e l'interpretazione dello stato bioenergetico cellulare.

Utilizzo dell'analizzatore di flusso metabolico cellulare in tempo reale per monitorare la bioenergetica degli osteoblasti

Qui, descriviamo in dettaglio i metodi per estrarre i macrofagi dal midollo osseo, dalla milza e dal cuore infartuato e successivamente valutare il flusso metabolico nelle cellule vive.

Analisi del flusso metabolico ex vivo nei macrofagi splenici e cardiaci e nei monociti del midollo osseo

Questo protocollo descrive un modo conveniente per eseguire un test di sforzo per la glicolisi al fine di quantificare la riprogrammazione metabolica nella microglia primaria del topo. Dopo l'isolamento e la stimolazione infiammatoria, il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) viene misurato utilizzando reagenti appena preparati e regolati per il pH, seguiti dalla normalizzazione proteica per consentire una valutazione accurata e riproducibile degli spostamenti glicolitici.

Indagine della glicolisi nella microglia primaria tramite test di flusso extracellulare

Scopri come la glutammina funge da fonte energetica per i macrofagi alveolari esposti a etanolo cronico utilizzando un bioanalizzatore di flusso extracellulare. Questo metodo consente misurazioni in tempo reale della respirazione mitocondriale.

Valutazione della glutammina come fonte di combustibile per macrofagi alveolari esposti a etanolo cronico utilizzando un bioanalizzatore di flusso extracellulare (Video) | JoVE Journal

Valutazione della glutammina come fonte di combustibile per macrofagi alveolari esposti a etanolo cronico utilizzando un bioanalizzatore di flusso extracellulare

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