Saggi automatizzati di immunofluorescenza multiplex ad alto rendimento per la ricerca traslazionale

Stiamo sviluppando kit per saggi di immunofluorescenza multiplex rapidi e sensibili. L'obiettivo è aiutare i ricercatori a profilare i diversi tipi di cellule che compaiono nel tessuto FFPE

L'immunofluorescenza viene comunemente eseguita utilizzando anticorpi secondari marcati con colorante o perossidasi. L'immunoistochimica tende ad essere a basso plesso. Gli anticorpi secondari marcati con colorante soffrono di un segnale più basso. I saggi di amplificazione del segnale Tyramide sono laboriosi da ottimizzare e richiedono da diverse ore a più giorni per essere eseguiti.

I marcatori dei saggi sono pre-ottimizzati ed è significativamente più veloce di altre tecniche. Stare in piedi con quattro marcatori richiede meno di otto ore e circa tre ore in più per ogni quattro biomarcatori aggiuntivi.

La capacità di eseguire più velocemente l'immunofluorescenza multiplex consentirà un'applicazione più ampia della proteomica spaziale e ridurrà la barriera alla comprensione della struttura spaziale del tessuto.

[Narratore] Per iniziare, scongelare tutti i reagenti del kit a temperatura ambiente. Conservare i coniugati anticorpali, l'enzima di amplificazione, l'iniziatore di scambio e il neutralizzatore di scambio a meno 20 gradi Celsius fino all'uso. Vortex: un diluente anticorpale scongelato. Pipettare il diluente anticorpale in un contenitore. Centrifugare brevemente e aggiungere tutti gli anticorpi nel contenitore 1 della soluzione colorante per anticorpi. Aggiungere il diluente anticorpale fornito a una diluizione da 1 a 100. Quindi utilizzare una pipetta per mescolare delicatamente la soluzione, evitando vortici. Agitare la soluzione miscelata di preamplificazione dopo lo scongelamento per miscelare accuratamente. Quindi aggiungere la soluzione nel rispettivo contenitore di miscelazione. Agitare il tampone di amplificazione e pipettare, miscelare l'enzima di amplificazione. Diluire l'enzima di amplificazione in un rapporto da 1 a 10 nel tampone di amplificazione per creare il tampone di amplificazione. Miscelare delicatamente pipettando, evitando vortici. Quindi agitare e centrifugare la soluzione di controcolorante nucleare fornita e diluire da 1 a 100 in acqua ultrapura. Successivamente, diluire 1 soluzione di sonde fluorescenti in un rapporto da 1 a 20 nel tampone della sonda. Inserire l'intera bacchetta del reagente nello strumento per consentire la misurazione dei volumi dei reagenti. Passare alla scheda Configurazione vetrini nella parte superiore del software di colorazione automatica una volta preparati tutti i reagenti. Fai clic sul pulsante Aggiungi studio e inserisci l'ID dello studio, il nome dello studio ed eventuali commenti allo studio, se necessario. In Volume di erogazione, selezionare 150 microlitri e scegliere *Dewax 4 Steps come metodo di preparazione. Se non è disponibile nell'elenco a discesa, aprire il menu Configurazione protocollo, selezionare la casella di controllo preferita e fare clic su OK. Dopo aver creato lo studio, fare clic sul pulsante Aggiungi diapositiva situato sul lato destro della schermata di configurazione della diapositiva. Immettere un nome univoco per la diapositiva in Commenti diapositiva. Impostare il tipo di tessuto su Test del tessuto nel campo appropriato. Quindi scegli 150 microlitri per Volume di erogazione e imposta la modalità di colorazione su Singola nel menu a discesa a sinistra e Routine nel menu a discesa a destra. In Processo, scegliere IHC e impostare il Marcatore sulla soluzione di colorazione degli anticorpi. Nella sezione Protocolli della finestra Aggiungi vetrino, selezionare Saggio di colorazione 1 per la colorazione, *Decerazione 4 passaggi per la preparazione e *HIER 20 minuti con ER2 per HIER. Lasciare l'opzione Protocollo enzimatico impostata su un trattino asterisco e fare clic su Aggiungi diapositiva quando tutti i campi sono completi. Dopo aver aggiunto tutti i vetrini, chiudere la finestra Aggiungi vetrino e stampare le etichette dei vetrini, apponendo ciascuna di esse sulla sezione di tessuto corrispondente. Caricare ogni vetrino etichettato sul vassoio e posizionare le tessere di copertura sopra ogni sezione di tessuto. Inserire il vassoio del vetrino nello strumento e selezionare l'auto stainer corrispondente dal lato destro dello schermo del software. Verificare che tutti e tre i vassoi dei vetrini e tutte le informazioni sui reagenti, inclusi i reagenti sfusi e preparati, siano visibili. Verificare che i contenitori dei reagenti sfusi siano adeguatamente riempiti e che i contenitori dei rifiuti abbiano un volume sufficiente per completare la corsa. Quindi premere il pulsante di riproduzione per iniziare la colorazione e garantire la rimozione tempestiva dei vetrini dal coloratore automatico una volta completata la procedura. Posizionare i vetrini macchiati nel tampone PBS e applicare i vetrini coprioggetti utilizzando il supporto di montaggio. Visualizzare i vetrini utilizzando un microscopio a fluorescenza o uno scanner per vetrini interi con filtri compatibili con i coloranti per saggi. Per il test di scambio, scongelare il tampone di scambio a temperatura ambiente. Conservare il neutralizzatore di scambio e l'iniziatore di scambio a una temperatura inferiore a 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Preparare due contenitori di titolazione dei reagenti e recuperare il kit di rilevamento da utilizzare durante il protocollo di scambio. Vortice il buffer di scambio. E pipetta miscelare l'iniziatore di scambio. Preparare la soluzione di scambio nel contenitore designato mescolando i volumi necessari dell'iniziatore di scambio e del buffer di scambio. Miscelare il contenuto solo pipettando. Unire ora la soluzione fluorescente probes 2 con il tampone di scambio diluito nel rispettivo contenitore. Vortex solo il tampone della sonda e la miscela della sonda fluorescente e la pipetta mescolano la soluzione finale. Posizionare l'intera bacchetta dei reagenti con tutti i reagenti preparati sull'autocolorante. Consentire alla macchina di eseguire un test di immersione su tutti i reagenti. Dopo aver aggiunto le diapositive, impostare l'indicatore su *Negativo. E per Preparazione, HIER ed Enzima, selezionare l'opzione trattino asterisco, poiché non è necessario il dewaxing o il recupero dell'antigene per il protocollo di scambio. Al termine, fare clic su Aggiungi diapositiva. Dopo aver aggiunto tutti i vetrini, chiudere la finestra Aggiungi vetrini e stampare le etichette dei vetrini da apporre su ciascuna sezione di tessuto corrispondente. Caricare ogni vetrino sul vassoio e posizionare una piastrella di copertura su ogni sezione di tessuto prima di posizionare il vassoio nel coloratore automatico. Ora premi il pulsante di riproduzione per avviare la corsa. Le immagini di un nucleo di microarray tissutale catturato in due cicli di colorazione utilizzando un protocollo di immunofluorescenza a otto plessi hanno mostrato marcatori immunitari distinti in ogni ciclo, con una co-registrazione dell'immagine riuscita che combina entrambi i cicli in un composito unificato. L'imaging dell'intero vetrino del tessuto tumorale del colon-retto ha permesso l'identificazione di fenotipi immunitari basati sulla colocalizzazione di marcatori, tra cui cellule T regolatorie, cellule T esaurite e macrofagi immunosoppressivi. La colorazione in immunofluorescenza ha mostrato la co-espressione di CD3, CD4 e FoxP3 nelle cellule T regolatorie. PD1 e PDL1 nelle cellule tumorali e stromali. CD3, CD8 e PD1 in cellule T citotossiche esauste. E CD 68 e PDL1 nei macrofagi immunosoppressivi. Il confronto tra l'immunoistochimica a singolo marcatore e l'immunofluorescenza singola o multipla ha confermato la concordanza qualitativa nei modelli di colorazione di tutti i marcatori. La colorazione seriale della sezione in diversi tipi di tessuto ha confermato modelli di espressione coerenti di marcatori immunitari con nuclei tissutali rappresentativi, mostrando una colorazione di successo e una variabilità minima. Le sezioni tonsilari colorate in sei vetrini seriali per CD8 hanno dimostrato un'elevata riproducibilità con una distribuzione del segnale quasi identica in tutte le immagini. La quantificazione delle densità cellulari positive dei marcatori tra i tipi di tessuto ha mostrato densità più elevate nelle tonsille e nei linfonodi e le più basse nel melanoma e nel colon.