Name: Saggi automatizzati di immunofluorescenza multiplex ad alto rendimento per la ricerca traslazionale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Scopri un protocollo automatizzato di immunofluorescenza multiplex ad alto rendimento per la ricerca traslazionale su tessuti FFPE. Questo metodo consente la profilazione spaziale di fenotipi immunitari con elevata riproducibilità.

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<ol><li>McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+research+applications+of+multiplexed+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> J Pathol. 254 (4), 405-417 (2021).</li>
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L'immunofluorescenza altamente multiplexata (mIF) è una tecnica avanzata che sta rivoluzionando il campo dell'analisi tissutale consentendo la visualizzazione simultanea di più biomarcatori proteici all'interno di una singola sezione di tessuto 1,2. Questa capacità fornisce un livello di dettaglio e una risoluzione spaziale senza precedenti, che è spesso cruciale per comprendere le interazioni tra tipi di cellule con morfologie complesse all'interno del microambiente tissutale su più scale spaziali3. La tecnica è particolarmente preziosa nella ricerca oncologica, dove può essere utilizzata per co-localizzare biomarcatori tumorali, bersagli di farmaci proteici, lo stato immunitario locale e di checkpoint, le interazioni tra diversi tipi di cellule e persino i modelli di colocalizzazione subcellulare correlati al metabolismo dei farmaci all'interno del tessuto 4,5,6.
Nonostante il suo potenziale, la maggior parte delle tecnologie mIF deve ancora affrontare sfide significative, in particolare nel bilanciare sensibilità e throughput con le capacità di multiplexing. Questa limitazione è particolarmente critica per il rilevamento di biomarcatori clinici che possono mostrare un'espressione molto bassa come HER2 e PD-L1 7,8,9. Per capire perché è così, è essenziale comprendere altre modalità di mIF. Questi metodi tradizionali hanno aperto la strada a piattaforme mIF più sofisticate, ma presentano una serie di vantaggi e limitazioni.
L'immunofluorescenza diretta (DIF) utilizza anticorpi direttamente coniugati ai fluorofori, o a un oligonucleotide in grado di reclutare fluorofori10. Questo metodo è semplice da multiplexare, ma soffre di una minore sensibilità e difficoltà a risolvere il segnale dal fondo tissutale o dagli artefatti di colorazione.
L'immunofluorescenza indiretta (IIF) utilizza un anticorpo secondario che si lega all'anticorpo primario. Questo ha aumentato il segnale rispetto al DIF basato sulla primaria. Se combinato con un design migliorato delle celle a flusso, l'IIF sequenziale può rilevare fino a 40 biomarcatori in un unico test 2,11. Tuttavia, questi soffrono ancora di una relativa mancanza di sensibilità rispetto alle strategie basate sugli enzimi per l'amplificazione del segnale, come quelle che si trovano nelle tecniche di immunoistochimica (IHC).
L'immunofluorescenza basata sulla catalisi enzimatica è più frequentemente osservata nei metodi IHC che utilizzano la perossidasi di rafano (HRP) per la deposizione di coloranti cromogenici (DAB) o fluorescenti (ad esempio, l'amplificazione del segnale della tiramide (TSA)). Poiché questi saggi si basano sullo stesso enzima catalitico, la loro sensibilità di rilevamento è simile, il che rende i saggi mIF multispettrali basati su TSA adatti per applicazioni cliniche 2,12. Il vantaggio dell'amplificazione del segnale basata sul DNA è l'elevato grado di multiplexing possibile, pur mantenendo un'eccellente amplificazione del segnale e modularità. Al contrario, i metodi basati su HRP sono meno modulari e difficili da ottimizzare, richiedendo ulteriori cicli di sviluppo e test del pannello.
Immunofluorescenza anticorpale con codice a barre del DNA Il test mIF qui dimostrato utilizza una DNA polimerasi per amplificare simultaneamente gli anticorpi con codice a barre del DNA, seguiti da cicli di colorazione e decolorazione della sonda reporter utilizzando quattro oligonucleotidi fluorescenti per ciclo di imaging (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig01.jpg"> 
Figura 1: Illustrazione grafica del protocollo del saggio di immunofluorescenza multiplex. Gli anticorpi coniugati con codice a barre vengono aggiunti in un unico passaggio e i codici a barre vengono amplificati contemporaneamente. In ogni ciclo vengono aggiunti gruppi di quattro sonde fluorescenti, consentendo di visualizzare quattro marcatori contemporaneamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
L'aggiunta di anticorpi a ciclo singolo e l'amplificazione a passaggio singolo semplificano notevolmente il protocollo di analisi. Il processo è facilitato da sistemi automatizzati di colorazione e scansione ad alto rendimento, che garantiscono risultati riproducibili da un vetrino all'altro e da un lotto all'altro su un gran numero di campioni utilizzati negli studi clinici13.
Uno dei principali vantaggi di questa tecnologia è la sua capacità di mantenere un'elevata sensibilità consentendo al contempo un ampio multiplexing2. Il flusso di lavoro garantisce inoltre che la produttività dell'imaging rimanga elevata, affrontando così uno dei principali limiti delle tecnologie mIF altamente multiplexate (ad esempio, &gt; 8 biomarcatori) per gli studi clinici. Ciò è particolarmente importante nella ricerca clinica, dove sottili variazioni nei bersagli farmacologici a bassa abbondanza (ad esempio, HER2 basso) tra i pazienti possono fornire informazioni critiche sulla risposta terapeutica.
Oltre a queste caratteristiche chiave, questo test offre anche la configurabilità del pannello, le capacità di imaging dell'intero vetrino ad alto rendimento e la risoluzione ottica necessaria per studiare i processi e i compartimenti subcellulari, nonché le sporgenze cellulari associate ai macrofagi e alle cellule dendritiche. La capacità di studiare fenotipi cellulari complessi su più scale spaziali è un vantaggio fondamentale dell'imaging ottico rispetto ai metodi basati sulla citometria di massa (IMC)2.
In questo lavoro, viene presentato un protocollo per un saggio mIF a 8 plessi utilizzando un autostainer e uno scanner per vetrini interi. Questo test include un pannello di otto anticorpi primari: CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1 e pan-citocheratina14. Questo pannello di marcatori consentirà l'immunoprofilazione del tessuto tumorale e l'identificazione delle cellule presenti nell'ambiente tumorale o stromale. Questo protocollo utilizza un coloratore automatico per vetrini per la colorazione iniziale e i cicli di scambio della sonda, e la colorazione e l'imaging possono essere completati entro 2 giorni. Vengono inoltre illustrati i metodi per convalidare un saggio mIF e condurre l'analisi delle immagini risultanti.

<table><tbody><tr><td>Clone Anti-CD3</td><td>Ultivue</td><td></td><td>BC33 (BioCare). Parte del ULT50801 clone</td></tr><tr><td>anti-CD4</td><td>Ultivue</td><td></td><td>SP35 (Abcam). Parte del ULT50801 clone</td></tr><tr><td>anti-CD68</td><td>Ultivue</td><td></td><td>KP1 (BioCare). Parte del clone</td></tr><tr>C8/144B ULT50801 <td>Ultivue</td><td></td><td>anti-CD8</td><td>(BioCare). Parte dei cloni ULT50801</td></tr><tr><td>anti-citocheratina + anti-SOX10</td><td>Ultivue</td><td></td><td>AE1/AE3 (Bethyl Labs) e BC34 (BioCare). Parte di ULT50801, fornito come miscela</td></tr><tr><td>Anti-FOXP3</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone 236A/E7 (Thermo). Fa parte del ULT50801 clone</td></tr><tr><td>anti-PD1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>CAL20 (Abcam). Parte del ULT50801</td></tr><tr><td>clone anti-PDL1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>73-10 (Abcam). Parte del ULT50801</td></tr><tr><td>microscopio Axioscan.Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>chiamato microscopio a fluorescenza nel testo</td></tr><tr><td>Soluzione di decera per bond</td><td>Leica</td><td>AR9222</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione per il recupero dell'epitopo di Bond 2</td> contenitori aperti <td>Leica</td><td>AR9640</td><td></td></tr> Bond, kit di <tr><td>rilevamento della ricerca</td><td></td> Leica OP309700 <td></td> Bond da 30 mL Leica DS9455 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserti per titolazione Bond Kit</td> di titolazione <td>Leica</td><td>OPT9049</td> Bond Leica OPT9719 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bond Universal Covertiles</td><td>Leica</td><td>S21.4611</td><td></td></tr><tr><td>Bond Wash Solution 10x Concentrato</td><td>Leica</td><td>AR9590</td><td></td></tr><tr><td>Autostainer BondRX</td><td>Leica</td><td></td><td>chiamato "autostainer" nel testo</td></tr><tr><td>Software BondRX</td><td>Leica</td><td></td><td>versione 6.0 o successiva</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti, spessore #1,5</td><td>Corning</td><td>2980-244</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, 200 proof</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>FFPE blocchi di tessuto</td><td>BioIVT</td><td></td><td>I tipi di tessuto variano</td></tr><tr><td>Saggio OmniVUE 8-plex (CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1, pan-citocheratina/SOX10)</td><td>Ultivue</td><td>ULT50801</td><td>contiene tutti gli altri componenti Ultivue</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Boston BioProducts</td><td>C-9911F</td> <td>(pH 7,4 con 2,7 mM KCl e 137 mM NaCl)</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo</td><td>P10144</td><td>chiamato "mezzo di montaggio" nel testo</td></tr><tr><td>UltiAnalyzer.AI</td><td>Ultivue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltiStacker.AI</td><td>Ultivue Ultivue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampliation Buffer</td><td>Ultivue</td><td></td><td>parte del</td></tr><tr><td></td> diluente <td></td><td>anticorpale Ultivue</td><td>ULT50801 parte di ULT50801</td></tr><tr><td>tampone di scambio Ultivue</td><td>Ultivue</td><td></td><td>parte dell ULT50801</td></tr><tr><td>iniziatore di scambio Ultivue</td><td>parte</td><td></td><td>del ULT50801</td></tr><tr><td>neutralizzatore di scambio Ultivue</td><td></td><td></td><td>parte di ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Fluorescent Probes 1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>parte di ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Fluorescent Probes 2</td><td>Ultivue</td><td></td><td>parte di ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Pre-Amplification Mix</td><td>Ultivue</td><td></td><td>parte di ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Probe Buffer</td><td>Ultivue</td><td></td><td>parte di ULT50801</td></tr><tr><td>Acqua ultrapura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

saggi automatizzati di immunofluorescenza multiplex ad alto rendimento per la ricerca traslazionale

High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assays for Translational Research

Seguendo il protocollo di cui sopra, il tessuto FFPE sarà colorato con bersagli multipli e sono state ottenute immagini di alta qualità di tutti i marcatori in gruppi di quattro (Figura 3A, B). Il software di co-registrazione delle immagini consentirà di combinare e co-registrare le immagini dello stesso vetrino, come mostrato nella Figura 3C. Risultati simili sono mostrati nella Figura 4 per un vetrino di tessuto per cancro del colon-retto (CRC).
Il successo del protocollo deve essere determinato valutando il modello di colorazione previsto. Nell'esempio di CRC mostrato, ciascuno dei bersagli colorati è espresso nel compartimento subcellulare atteso, ad esempio FoxP3 nucleare, CD3 membranoso, CD68 citoplasmatico (Figura 4B-D). Ciascuno dei bersagli funzionali è espresso sul tipo cellulare appropriato, come dimostrato dall'esempio della co-localizzazione di PD1 e CD3 o di PDL-1 e CD68, che mostrano rispettivamente cellule T esaurite e macrofagi immunosoppressivi. La valutazione di un buon rapporto segnale/sfondo, che consente di distinguere con successo il vero segnale positivo dal potenziale rumore di fondo, viene solitamente eseguita qualitativamente da patologi o esperti di analisi delle immagini che confermano la qualità della colorazione, consentendo un'analisi delle immagini di successo. Per confermare ulteriormente la qualità e le prestazioni della colorazione, è possibile aggiungere il confronto con il gold standard IHC (DAB cromogenico) su sezioni seriali (vedere l'esempio nella Figura 5), nonché un campione di tessuto di controllo positivo come la tonsilla umana che, per la maggior parte dei bersagli immunitari, può essere utile per confermare il successo della colorazione. Si noti che i tumori possono mostrare un'espressione inferiore dei bersagli rispetto alla tonsilla16 umana.
Dopo che i risultati sono stati confermati qualitativamente, è possibile eseguire un'analisi quantitativa. In questo lavoro, ciò consiste principalmente nel calcolare la densità cellulare di diversi fenotipi (numero di cellule/mm2) che esprimono un determinato bersaglio o bersagli, nonché nel calcolare i livelli medi di intensità di bersagli funzionali che possono mostrare un ampio intervallo dinamico di espressione. Nel valutare la precisione dei saggi mIF, le sezioni seriali colorate con gli stessi marcatori dovrebbero mostrare segnali comparabili tra i vetrini, come si può vedere qualitativamente nella Figura 6. Esempi di risultati quantitativi delle densità di singoli marcatori in diversi tipi di tessuto sono mostrati nella Figura 7. L'analisi delle immagini su queste immagini consente di identificare le cellule positive e di calcolare una corrispondente densità di cellule positive per ciascun marcatore, nonché l'intensità media del segnale per cella positiva. Ciò consente di calcolare un coefficiente di variabilità (CV) per ciascun marcatore per valutare la precisione del test di multiplexing (Tabella 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig03.jpg"> 
Figura 3: Immagini di un nucleo di microarray tissutale (TMA) ottenute da cicli successivi di colorazione nel protocollo di immunofluorescenza a 8 plex. (A) Immagine ottenuta dal primo ciclo di imaging, con i marcatori CD8, PD1, PD-L1 e CD68. Dopo il protocollo di scambio, (B) mostra il secondo ciclo di imaging sullo stesso vetrino per il secondo ciclo di marcatori CD3, CD4, FoxP3 e CK/SOX10 e (C) mostra un'immagine co-registrata che combina le immagini (A) e (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig04.jpg"> 
Figura 4: Colorazione rappresentativa del tessuto del cancro del colon-retto (CRC) con colorazione in immunofluorescenza a 8 plex. La figura mostra i fenotipi cellulari che possono essere identificati co-localizzando più bersagli nella stessa cellula. (inizio) Immagine dell'intero vetrino del tessuto CRC. (in basso) Viste dettagliate delle regioni di evidenziazione tissutale (A) cellule T-reg (CD3+/CD4+/FOXP3+), (B) cellule che esprimono PD-1 e PD-L1 all'interno del tumore e dello stroma, (C) cellule T citotossiche esaurite (CD3+/CD8+/PD-1), (D) cellule tumorali che eludono il sistema immunitario (PD-L1+/CK+) e macrofagi immunosoppressivi (CD68+/PDL1+). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig05.jpg"> 
Figura 5: Confronto qualitativo tra l'immunoistochimica (IHC) e la colorazione in immunofluorescenza (IF). Sezioni seriali colorate con colorazione immunoistochimica a marcatore singolo (DAB, riga superiore), immunofluorescenza a marcatore singolo (ISP monoplex) e vista a canale singolo dell'immunofluorescenza multiplex (ISP multiplex) che dimostrano la concordanza qualitativa tra i diversi metodi di colorazione. Barre di scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig06.jpg"> 
Figura 6: Colorazione della sezione seriale. (A) Diagramma che mostra il layout di un TMA multitessuto. (B) Immagini rappresentative a 8 plessi di nuclei di tessuto di ciascun tipo di tessuto nella TMA. (C) Immagini rappresentative di CD8 in un nucleo tonsillare attraverso sei sezioni seriali di TMA colorate in un'unica corsa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig07.jpg"> 
Figura 7: Quantificazione della densità di un singolo marcatore per tipo di tessuto inclusa nella TMA. Le densità per tessuto sono le densità medie tra tre nuclei rappresentativi di ciascun tipo di tessuto sul vetrino TMA. L'asse y rappresenta le densità dei singoli marcatori in diversi tipi di tessuto sull'asse x, in unità di cellule positive/mm2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig08.jpg"> 
Figura 8: Analisi della regione di interesse (ROI) del segnale fluorescente relativo confrontando l'mIF ISP amplificato descritto in questo protocollo con l'IF indiretto. (A) Vetrino rappresentativo colorato per CK (a sinistra) o PD-L1 (a destra) con cinque ROI indicati. (B) Immagini rappresentative del ROI per CK (in alto) e PD-L1 (in basso). Intensità media del segnale ottenuta con mIF amplificato (viola) e IF indiretto (blu) per (C) CK e (D) PD-L1 in cinque ROI, ciascuno dei quali misura 100 μm x 100 μm e contiene circa 200 celle. I valori dell'asse Y mostrano unità fluorescenti arbitrarie e le barre di errore mostrano le deviazioni standard (n=3). (E) L'intensità relativa del segnale ottenuta con l'IF ISP amplificato (viola) e l'IF indiretto (blu) è stata calcolata prendendo il rapporto tra il segnale mIF amplificato medio e il segnale IF indiretto medio in tutte le ROI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig08large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 4: Coefficiente di varianza (CV) calcolato. Il CV della densità cellulare positiva e l'intensità media del segnale per le immagini delle tonsille sono mostrati nella Figura 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/Table04_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Saggi automatizzati di immunofluorescenza multiplex ad alto rendimento per la ricerca traslazionale

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Qui descrivere un ottimizzato trascrittasi inversa multiplex PCR quantitativa (QRT-PCR) protocollo in combinazione con una piattaforma microfluidica come un efficace costi e tempi high-throughput screening per microRNA (miRNA) livelli di espressione, soprattutto quando si lavora con quantità limitate di campione.

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Presentiamo in questo studio un test basato sulla fluorescenza romanzo utilizzando linfociti derivati ​​da un topo transgenico. Questo test è adatto per high-throughput screening (HTS) di piccole molecole dotate di capacità di una inibizione o la promozione di attivazione dei linfociti.

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