Name: Elettroporazione di organoidi corticali umani affettati per studi di funzione genica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Scopri l'elettroporazione di organoidi corticali umani affettati per studiare la funzione genica nelle cellule progenitrici neurali. Questo metodo facilita l'analisi dello sviluppo corticale umano e dei disturbi neuropsichiatrici.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Knockout genico CRISPR/Cas9 in organoidi corticali umani affettati tramite elettroporazione

Provette da <table><tbody><tr><td>centrifuga in PP da 15 mL, coniche</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector Core Unit</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X Unit</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL in polistirene provetta a fondo tondo con tappo per filtro a celle</td><td>Corning</td><td>Falcon 352235</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 6 pozzetti, Thermo</td><td>Fisher</td><td>140675</td> trattato con nunclon <td>per hiPSC piastra</td></tr><tr><td>a 6 pozzetti per coltura, attacco ultra basso</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Per coltura di organoidi</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72022</td><td>Terreno proencefalico 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Compressore d'aria</td><td>Aerotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>703-545-155</td><td>Anticorpo secondario, RRID: AB_2340375; diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>Anticorpo secondario, RRID: AB_162543; diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol</td><td>Tecnologie</td><td></td> DNA integrate <td>Design personalizzato (ordinare come 2 nmol)</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA Tecnologie</td><td>DNA integrate</td><td>1072532</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nucleasi V3</td><td>Tecnologie DNA integrate</td><td>1081060</td><td>100 &; g, da Streptococcus pyogenes</td></tr><tr><td>Amfotericina B (Fungizone)</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td>Proencefalo terreno 2, 3 e 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-GFP (pollo, policlonale)</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>RRID: AB_300798; diluizione 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-PCGF4 (topo, monoclonale)</td><td>Millipore</td><td>05-637&nbsp;</td><td>RRID: AB_309865; diluizione 1:300</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente ApoTome</td><td>Zeiss</td> Acido Ascorbico <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>1043003</td><td>Proencefalo medium 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>B27-integratore (+ vitamina A)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Proencefalo medium 3, 4&nbsp; &nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Kit di cavi da banana a micrograbber</td><td>Apparecchio Harvard BTX</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Biometra TRIO-Thermocycler (macchina PCR)</td><td>Analytik Jena</td><td>846-2-070-723</td><td></td></tr><tr><td>Capillari, vetro borosilicato con filamento, OD 1,2 mm; ID 0,69 mm; 10 cm di lunghezza</td><td>Scienza Prodotti</td><td>BF120-69-10</td><td>Deve essere tirato a spessore specifico</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72052</td><td>Proencefalo medio 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>CRTDi004-A</td><td>Impianto di ingegneria delle cellule staminali presso CMCB DD</td><td>https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A</td><td>Linea hiPSC adattata a singola cellula da donatore sano</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>1 mg/mL, utilizzare 1:1000 diluito per IF</td></tr><tr><td>Dibutirril-cAMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>73884</td><td>Proencefalo medio 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>31330095</td><td>Forebrain medium 1, 2 e 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72102</td><td>Proencefalo medium 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinze, dritto, 11 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 Sistema di elettroporazione a onda quadra</td><td>Apparecchio Harvard BTX</td><td>45-2052</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>FCF Sigma Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>SH30070.03&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Per l'estrazione di microcapillari</td></tr><tr><td>Geneious Prime</td><td>GraphPad Software LLC d.b.a Geneious</td><td>Software versione 2024.0.5</td><td></td></tr><tr><td>gLACZ</td><td>Kalebic et al., 2016; Platt et al., 2014</td><td></td><td>5'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; nucleotidi sottolineati = PAM</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050038</td><td>Terreno del proencefalo 1, 2, 3 e 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>gPCGF4 KO1</td><td>questo articolo</td><td></td><td>5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (corrisponde alle immagini KO in Figura 3I+J)</td></tr><tr><td>gPCGF4 KO2</td><td>questo articolo</td><td></td><td>5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (corrisponde al KO immagini in Figura 3I+J)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>prodotto in casa</td><td></td><td>1 M stock</td></tr><tr><td>Siero di cavallo, inattivato termicamente</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Proteina ricombinante GDNF umana</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-10</td><td>Mezzo proencefalico 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Proteina ricombinante BDNF umana/topo/ratto</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-02</td><td>Proencefalo medio 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258148</td><td>Per fare TrisHCl</td></tr><tr><td>ImmEdge (cera) Penna</td><td>Vettoriale Laboraories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di insulina umana</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; I9278</td><td>Proencefalo medio 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Siero di sostituzione knockout</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10828-010</td><td>Proencefalo medio 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Microscopio confocale 980 a scansione laser</td><td>Agarosio Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>a basso punto di fusione,</td> 16520100 <td>Thermo Fisher</td> ultra puro <td>per l'inclusione di hCOs durante il sezionamento del vibratomo</td><td></td></tr><tr><td>Matrice a membrana basale con fattore di crescita ridotto (GFR) Matrigel, senza LDEV</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Per la coltura</td></tr> <tr><td>di organoidiMatrice qualificata Matrigel hESC, senza LDEV</td><td></td><td>Corning 354277</td><td>Per coltura hiPSC</td></tr><tr><td>MgCl2, 1 M</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Microiniettore PicoPump + Interruttore a pedale</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Microloader Puntali per pipette da 0,5 a 20 e micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Per il caricamento di capillari in vetro</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>Integratore di cellule staminali</td></tr><tr><td>N-2 Integratore</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>Forebrain 2 e 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NEB Next Mastermix PCR 2x ad alta fedeltà&nbsp;</td>Camera di conteggio <td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer</td><td>Marca</td><td>718605</td><td></td></tr><tr><td>Medium neurobasale</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Forebrain medium 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11140050</td><td>Terreno del proencefalo 1, 2, 3 e 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Tampone duplex privo di nucleasi Tecnologie</td><td>DNA integrate</td><td>1072570</td><td></td></tr><tr><td>O. C. T. Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Terreno di inclusione per campione di tessuto congelato</td></tr><tr><td>P3 Cellula primaria 4D-Nucleofector X Kit S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Fisher Chemical</td><td>P/0840/53</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way Stampo per inclusione troncatoT12</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986-1</td><td>Per l'inclusione di hCO per vibratomo e criosezione</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Forebrain medium 1, 2, 3 e 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 e per il terreno delle cellule staminali dopo nucleofeczione</td></tr><tr><td>Piastra di Petri 60 mm x 15 mm, senza sfiato, sterile</td><td>Corning</td><td>BP50-02</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri Camera dell'elettrodo in platino, interasse 5 mm</td><td>Apparecchio Harvard BTX</td><td>45-0504</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td> <td>prodotta internamente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td>Da Titrachium album; 10 mg/mL stock</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della via RHO/ROCK (Y-27632)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72232</td><td>Terreno proencefalico 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Citrato di sodio diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio&nbsp;</td><td>Vetrini di adesione Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>SZX10 con un KL 300 LED</td><td>Olympus</td><td>SZX10</td><td>O stereoscopio alternativo</td></tr><tr><td>Thermo Shaker</td><td>Grant bio</td><td>PSC24N</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td>a.k.a. Octoxinol 9</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td>Per fare TrisHCl</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4%</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604021</td><td>Dissociazione enzmye per fare sospensioni unicellulari</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>a.k.a. Polisorbato 20</td></tr><tr><td>Sale di Tyrode</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2145-10x1l</td><td></td></tr><tr><td>Vibrante Microtomo (vibratomo)</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Wide-Bore 1000 &; L Puntali Filtro Universali Corning</td><td></td><td>TF-1005-WB-R-S</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanolo</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21985-023</td><td>Proencefalo medio 1, 3 e 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr></tbody></table>

elettroporazione di organoidi corticali umani affettati per studi di funzione genica

Electroporation of Sliced Human Cortical Organoids for Studies of Gene Function

L'ablazione genica mediata da CRISPR/Cas9 richiede la progettazione di gRNA. Generalmente, il targeting di uno dei primi esoni di un gene di interesse con una coppia di gRNA distanziati di 7-11 bp l'uno dall'altro (evitando multipli di 3 bp) funziona bene (Figura 1A). Come primo test, l'efficienza del riconoscimento del modello da parte dei gRNA può essere interrogata in vitro utilizzando un modello di PCR 26,40,62. Il targeting efficiente e il taglio mediato da Cas9 sono visibili nella riduzione del DNA stampo e nella comparsa di prodotti di DNA scissi su un gel di agarosio (Figura 1B). Ulteriori test del gRNA possono essere eseguiti nella linea iPSC utilizzata per la generazione di organoidi corticali. Ciò richiede la nucleofezione di iPSC, che può essere visualizzata mediante un'espressione reporter fluorescente riuscita (Figura 1C). Il targeting efficiente del locus di interesse può essere verificato mediante sequenziamento Sanger, risultando in un cromatogramma che termina bruscamente o si sovrappone attorno al sito di targeting (Figura 1D), risultante da uno spettro di indel dalla riparazione della rottura del doppio filamento mediante l'unione di estremità non omologa66. I test di efficienza dell'RNA guida in vitro e in cellule iPSC aiutano a selezionare coppie di gRNA efficienti per l'ablazione genica negli organoidi corticali.
Prima dell'elettroporazione, gli organoidi corticali vengono affettati, il che supporta l'identificazione dei lumi ventricolari per l'iniezione della miscela di elettroporazione (Figura 2A-C). Gli organoidi iniettati vengono quindi trasferiti nella camera di elettroporazione (Figura 2D). Per l'elettroporazione, dovrebbero essere utilizzati organoidi corticali con strutture ventricolari ben sviluppate (Figura 2E), mentre gli organoidi corticali privi di strutture visibili dovrebbero essere scartati (Figura 2F). La miscela per elettroporazione contiene un colorante che consente la visualizzazione dei ventricoli iniettati durante la procedura (Figura 2G). Dopo 1-3 giorni di coltura, i ventricoli mirati con successo sono visibili dal segnale GFP nativo al microscopio a fluorescenza (Figura 2H).
Per un'analisi istologica approfondita, è possibile eseguire l'immunoistochimica delle criosezioni. Idealmente, più ventricoli mirati sono presenti all'interno di un organoide corticale elettroporato (Figura 3A, B). Le elettroporazioni più ottimali mirano a strutture simili a ventricole nella regione esterna dell'organoide rivolta verso l'esterno (Figura 3C), poiché questi sono tipicamente i ventricoli più espansi. In alcuni casi, l'elettroporazione può portare a un'eccessiva morte cellulare (Figura 3D, E), ad esempio, quando le concentrazioni di plasmidi sono troppo elevate o le impostazioni di elettroporazione sono subottimali. Le elettroporazioni rivolte verso l'interno dell'organoide (Figura 3F) spesso coinvolgono regioni meno espanse delle strutture ventricolari rispetto all'esterno. Nella nostra esperienza, è utile concentrare l'analisi quantitativa su regioni definite dell'organoide per ridurre la variabilità. A volte, l'elettroporazione può causare l'interruzione della superficie apicale (Figura 3G), ad esempio, quando il volume di iniezione è troppo elevato, causando la rottura dei ventricoli, o quando gli impulsi elettrici sono troppo forti, portando alla delaminazione cellulare. Infine, quando due ventricoli adiacenti sono presi di mira (Figura 3H), può diventare difficile assegnare i confini delle zone corticali e l'origine delle cellule bersaglio.
L'immunoistochimica può essere utilizzata per verificare il successo del knockout mediato da CRISPR/Cas9 a livello proteico nelle cellule di interesse (Figura 3I), esemplificato qui prendendo di mira la proteina PCGF467 del Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1). L'intensità del segnale può essere analizzata in cellule GFP-positive in condizioni di controllo rispetto a quelle sperimentali (Figura 3J). In alternativa, se non è disponibile un anticorpo adatto, le cellule bersaglio possono essere isolate mediante FACS da organoidi corticali60 e ulteriormente analizzate mediante Sanger o Next Generation Sequencing36. Inoltre, la riduzione dei livelli proteici può essere analizzata anche utilizzando il Western blotting.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig1v5.jpg"> 
Figura 1: Progettazione e validazione dell'RNA guida per il knockout genico acuto mediato da CRISPR/Cas9. (A) Illustrazione schematica della strategia di progettazione dell'RNA guida (gRNA), con due gRNA che hanno come bersaglio un esone di un gene di interesse. Le frecce nere indicano i primer PCR per la preparazione del modello utilizzati per la convalida del gRNA. (B) Validazione dell'efficienza del gRNA in vitro. I modelli amplificati con PCR sono stati digeriti con complessi RNP. Dopo la scissione riuscita, due bande di dimensioni diverse sono visibili dopo l'elettroforesi su gel (a sinistra), mentre il modello rimane non tagliato per i gRNA a bassa efficienza (a destra). (C) Immagine in campo chiaro (a sinistra), fluorescenza GFP (al centro) e immagini unite (a destra) di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) 3 giorni dopo la nucleofeczione con il complesso RNP e un plasmide GFP. Barre della scala: 350 μm. (D) Convalida dell'efficienza del gRNA nelle hiPSC mediante sequenziamento Sanger di DNA amplificato da cellule GFP-positive. Dopo la scissione riuscita del DNA a doppio filamento, le tracce di sequenziamento mostrano segnali sovrapposti a partire dal sito bersaglio del gRNA (in alto, KO1). In caso di targeting non riuscito, la traccia della sequenza del DNA rimane invariata (in basso, KO2) rispetto al controllo LACZ . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig2v5.jpg"> 
Figura 2: Elettroporazione di organoidi corticali umani affettati. (A) Illustrazione schematica che mostra il flusso di lavoro per l'elettroporazione di organoidi corticali umani (hCO). In primo luogo, gli hCO vengono sezionati in fette spesse 500 μm. Due giorni dopo, la miscela RNP contenente un plasmide di espressione GFP e Fast Green viene iniettata nei lumi di strutture simili a ventricoli, preferenzialmente nella regione esterna degli hCO. Per l'elettroporazione, gli hCO vengono inseriti nella camera di elettroporazione. Dopo diversi giorni di coltura, è possibile rilevare un segnale GFP nelle aree elettroporate. (B) Immagini del sezionamento vibratomico di hCO. Gli organoidi sono incorporati in agarosio a basso punto di fusione al 3% in un mezzo in un blocco (a sinistra). Il blocco viene sezionato in fette di 500 μm di spessore (al centro). Gli organoidi affettati vengono trasferiti nuovamente nel piatto di coltura con una punta della pipetta a foro largo (a destra). (C) Immagini che mostrano l'iniezione della miscela contenente RNP, pCAG-GFP e 0,1% Fast Green in strutture ventricolari degli organoidi. Gli organoidi sono immersi nella soluzione di Tyrode e il sottile capillare di vetro è inserito nel lume del centro delle strutture ventricolari (a sinistra). Le pinze vengono utilizzate per stabilizzare gli organoidi (sinistro e centrale). I ventricoli all'esterno degli organoidi sono mirati (al centro). Gli organoidi iniettati vengono trasferiti nella camera di elettroporazione, o successivamente nel piatto di coltura, con puntali di pipetta a foro largo (a destra). (D) Immagini della camera di elettroporazione, che è composta da una capsula di Petri di vetro e due lame metalliche incollate al vetro. Le lame metalliche fungono da elettrodi e contengono fori per fissare i cavi da collegare all'elettroportatore. Il lato iniettato dell'hCO, visibile attraverso un'ombra verde, deve essere rivolto verso l'anodo (polo positivo, cavo rosso) (a destra). (E) Immagini rappresentative di hCO che mostrano strutture simili a ventricole ben sviluppate. L'anello più chiaro rappresenta l'area simile alla zona ventricolare. Il cerchio più scuro al centro della struttura ventricolare rappresenta il lume e dovrebbe essere mirato per l'iniezione. (F) Immagini rappresentative di hCO prive di strutture ventricolari ben sviluppate, che si consiglia di non includere per ulteriori esperimenti. (G) Immagini rappresentative di hCO dopo l'iniezione della miscela di elettroporazione, in cui le aree mirate sono visibili da Fast Green (frecce arancioni). (H) Immagine rappresentativa di hCO che mostra il segnale nativo della GFP 24 ore dopo l'elettroporazione. Barre di scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig3v5.jpg"> 
Figura 3: Analisi immunoistochimica di organoidi corticali umani affettati elettroporati. (A) Schema che rappresenta un organoide corticale umano elettroporato (hCO) con segnale fluorescente verde. (B) Colorazione DAPI (grigio) e immunofluorescenza per GFP (verde) di un hCO criosezionato con ventricoli elettroporati multipli, 7 giorni dopo l'elettroporazione. (C-H) Immagini di esempio di diversi risultati di elettroporazione, colorati per GFP (verde) e nuclei (DAPI, grigio). (C) Un'elettroporazione ottimale con nuclei intatti (vedi inserto 1, D), una struttura ventricolare ininterrotta e cellule elettroporate nell'area rivolta verso l'esterno dell'organoide, che di solito è più espansa. (E) Esempio di hCO che mostra una massiccia morte cellulare nell'area elettroporata (vedi anche inserto 2, D), caratterizzata da nuclei piccoli, densi di DAPI e distorti. (F) Una corretta elettroporazione diretta verso l'interno dell'organoide, che è spesso più difficile da interpretare a causa delle aree corticali simili a placche che si fondono con i ventricoli adiacenti. (G) Strutture ventricolari interrotte al centro dell'area elettroporata (freccia arancione). (H) Un esempio di hCO contenente più ventricoli più piccoli che sono parzialmente fusi e, quindi, difficili da quantificare. (I) Colorazione DAPI (grigio) e immunofluorescenza per GFP (verde) e PCGF4 (magenta) 7 giorni dopo l'elettroporazione di un complesso RNP mirato a LACZ (gLACZ KO, a sinistra) o PCGF4 (gPCGF4 KO, a destra) per knockout mediato da CRISPR/Cas9. Le cellule cerchiate evidenziano la ridotta intensità di PCGF4, indicando il successo dell'ablazione genica. Un segnale uniforme può essere visto nel controllo LACZ (a sinistra). (J) Il grafico mostra l'intensità quantificata di PCGF4 dopo immunofluorescenza in cellule GFP-positive per il controllo (gLACZ KO) e il KO di PCGF4 (gPCGF4 KO) rispetto all'espressione mediana di PCGF4 nella condizione gLACZ. Ogni punto rappresenta una cella. Dati provenienti da 3-4 organoidi provenienti da due lotti diversi (grigio e nero) della stessa linea hiPSC. p &lt; 0,0001, test di Mann-Whitney. Tutte le immagini sono state acquisite con un microscopio confocale a scansione laser (B, C) o fluorescente (E-I). Le immagini rappresentano proiezioni di intensità massima di z-stack di 10-15 μm di spessore. Le linee tratteggiate bianche indicano la superficie apicale rivolta verso il lume del ventricolo e le superfici esterne degli hCO. Le linee tratteggiate arancioni indicano il bordo VZ/SVZ nei ventricoli uniti. Barre di scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anticorpo/Colorante</td>
			<td>Diluizione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pollo anti-GFP</td>
			<td>1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PCGF4</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Asino Anti-Pollo</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Asino Anti-Coniglio</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>1 mg/mL di brodo; 1:1,000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Elenco degli anticorpi e dei coloranti e della loro diluizione utilizzati per la colorazione in immunofluorescenza.

Elettroporazione di organoidi corticali umani affettati per studi di funzione genica

Human cortical organoids have become important tools for studying human brain development, neurodevelopmental disorders, and human brain evolution. ...

electroporation-sliced-human-cortical-organoids-for-studies-gene

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questa procedura descrive un metodo per l'isolamento e la cultura dell'organo murino di Corti con o senza il limbus spirale e dei neuroni del ganglio spirale. Abbiamo anche dimostrare un metodo per l'espressione di un gene esogeno giornalista nell'organo di Corti espianto di elettroporazione.

Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell&#39;Organo murini di Corti.

Elettroporazione in utero è un metodo prezioso per trasfezione delle cellule progenitrici neuronali in vivo. A seconda del posizionamento degli elettrodi e la timepoint sviluppo di elettroporazione, alcuni sottoinsiemi di cellule corticali può essere mirati. Cellule bersaglio può quindi essere analizzato in vivo o in vitro per gli effetti di alterazione genetica.

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

Per condurre una rapida valutazione della funzione dei geni nello sviluppo della corteccia cerebrale, si descrivono i metodi che comportano...

Metodi per lo studio della morfogenesi neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elettroporazione RNAi in Embryonic Cerebral Cortex Murine

Questo video dimostra il protocollo per l'elettroporazione di geni a singola cellula sia nei neuroni eccitatori che in quelli inibitori in una serie di colture di fette di ippocampo in vitro. La tecnica è utile per esaminare specifiche funzioni molecolari e fisiologiche dei neuroni, compresi i meccanismi autonomi delle cellule e le interazioni proteiche transsinaptiche.

Elettroporazione di singole cellule in colture organotipiche di fette di cervello: una tecnica in vitro per fornire plasmidi all'interno di neuroni mirati in fette di ippocampo cerebrale

Questo protocollo descrive un procedimento di espianto che...

Ex utero elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale

La doppia elettropozione in utero consente di colpire le popolazioni cellulari separate spazialmente e temporaneamente. Questa tecnica è utile per visualizzare le interazioni tra quelle popolazioni cellulari utilizzando proteine fluorescenti in condizioni normali, ma anche dopo esperimenti funzionali per perturbare i geni di interesse.

Doppia elettroporazione in utero per colpire le popolazioni di cellule temporali e separate spazialmente

Presentato qui è un protocollo per l'elettroporazione a singola cellula in grado di fornire geni sia nei neuroni eccitatori che inibitori in una vasta gamma di età della coltura di fette ippocampali in vitro. Il nostro approccio fornisce un'espressione precisa ed efficiente dei geni nelle singole cellule, che può essere utilizzata per esaminare le funzioni cellulari autonome e intercellulari.

Elettroporazione a cella singola attraverso diverse culture di fette organotipiche di neuroni eccitatori ippocampali del topo e specifici della classe

L'elettroporazione degli organoidi cerebrali dei primati fornisce un approccio preciso ed efficiente per introdurre modificazioni genetiche transitorie in diversi tipi di progenitori e neuroni in un sistema modello vicino allo sviluppo della neocorteccia (pato)fisiologica dei primati. Ciò consente lo studio dei processi neuroevolutivi e di sviluppo e può essere applicato anche per la modellizzazione delle malattie.

Microiniezione mirata ed elettroporazione di organoidi cerebrali di primati per la modificazione genetica

Pulcino colture di cellule della retina embrionali costituiscono validi strumenti per lo studio della biologia dei fotorecettori. Abbiamo sviluppato una tecnica di trasferimento genico efficace sulla base di ex ovo plasmide elettroporazione delle retine precedenti alla cultura. Questa tecnica aumenta considerevolmente l'efficienza di transfezione su protocolli attualmente disponibili, rendendo la manipolazione genetica fattibile per questo sistema.

Trasferimento efficiente Gene in Chick retine per cellulari primarie Cultura Studies: An Ex-ovo Elettroporazione Approach

Presentiamo un metodo che descrive l'isolamento e la coltura di espianti cocleari dall'orecchio interno di topo embrionale.  Dimostriamo anche un metodo per il trasferimento genico in espianti cocleari tramite elettroporazione a onda quadra. La coltura di espianti in vitro abbinata alla tecnica di trasferimento genico consente ai ricercatori di studiare gli effetti dell'alterazione dell'espressione genica durante lo sviluppo.

Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

Scopri l'elettroporazione di organoidi corticali umani affettati per studiare la funzione genica nelle cellule progenitrici neurali. Questo metodo facilita l'analisi dello sviluppo corticale umano e dei disturbi neuropsichiatrici.

Elettroporazione di organoidi corticali umani affettati per studi di funzione genica

Esplora altri video