Name: Elettroporazione di organoidi corticali umani affettati per studi di funzione genica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Scopri l'elettroporazione di organoidi corticali umani affettati per studiare la funzione genica nelle cellule progenitrici neurali. Questo metodo facilita l'analisi dello sviluppo corticale umano e dei disturbi neuropsichiatrici.

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<meta charset="utf8"></head><body>Knockout genico CRISPR/Cas9 in organoidi corticali umani affettati tramite elettroporazione

Provette da <table><tbody><tr><td>centrifuga in PP da 15 mL, coniche</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector Core Unit</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X Unit</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL in polistirene provetta a fondo tondo con tappo per filtro a celle</td><td>Corning</td><td>Falcon 352235</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 6 pozzetti, Thermo</td><td>Fisher</td><td>140675</td> trattato con nunclon <td>per hiPSC piastra</td></tr><tr><td>a 6 pozzetti per coltura, attacco ultra basso</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Per coltura di organoidi</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72022</td><td>Terreno proencefalico 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Compressore d'aria</td><td>Aerotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>703-545-155</td><td>Anticorpo secondario, RRID: AB_2340375; diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>Anticorpo secondario, RRID: AB_162543; diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol</td><td>Tecnologie</td><td></td> DNA integrate <td>Design personalizzato (ordinare come 2 nmol)</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA Tecnologie</td><td>DNA integrate</td><td>1072532</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nucleasi V3</td><td>Tecnologie DNA integrate</td><td>1081060</td><td>100 &; g, da Streptococcus pyogenes</td></tr><tr><td>Amfotericina B (Fungizone)</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td>Proencefalo terreno 2, 3 e 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-GFP (pollo, policlonale)</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>RRID: AB_300798; diluizione 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-PCGF4 (topo, monoclonale)</td><td>Millipore</td><td>05-637&nbsp;</td><td>RRID: AB_309865; diluizione 1:300</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente ApoTome</td><td>Zeiss</td> Acido Ascorbico <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>1043003</td><td>Proencefalo medium 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>B27-integratore (+ vitamina A)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Proencefalo medium 3, 4&nbsp; &nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Kit di cavi da banana a micrograbber</td><td>Apparecchio Harvard BTX</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Biometra TRIO-Thermocycler (macchina PCR)</td><td>Analytik Jena</td><td>846-2-070-723</td><td></td></tr><tr><td>Capillari, vetro borosilicato con filamento, OD 1,2 mm; ID 0,69 mm; 10 cm di lunghezza</td><td>Scienza Prodotti</td><td>BF120-69-10</td><td>Deve essere tirato a spessore specifico</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72052</td><td>Proencefalo medio 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>CRTDi004-A</td><td>Impianto di ingegneria delle cellule staminali presso CMCB DD</td><td>https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A</td><td>Linea hiPSC adattata a singola cellula da donatore sano</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>1 mg/mL, utilizzare 1:1000 diluito per IF</td></tr><tr><td>Dibutirril-cAMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>73884</td><td>Proencefalo medio 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>31330095</td><td>Forebrain medium 1, 2 e 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72102</td><td>Proencefalo medium 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinze, dritto, 11 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 Sistema di elettroporazione a onda quadra</td><td>Apparecchio Harvard BTX</td><td>45-2052</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>FCF Sigma Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>SH30070.03&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Per l'estrazione di microcapillari</td></tr><tr><td>Geneious Prime</td><td>GraphPad Software LLC d.b.a Geneious</td><td>Software versione 2024.0.5</td><td></td></tr><tr><td>gLACZ</td><td>Kalebic et al., 2016; Platt et al., 2014</td><td></td><td>5'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; nucleotidi sottolineati = PAM</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050038</td><td>Terreno del proencefalo 1, 2, 3 e 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>gPCGF4 KO1</td><td>questo articolo</td><td></td><td>5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (corrisponde alle immagini KO in Figura 3I+J)</td></tr><tr><td>gPCGF4 KO2</td><td>questo articolo</td><td></td><td>5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (corrisponde al KO immagini in Figura 3I+J)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>prodotto in casa</td><td></td><td>1 M stock</td></tr><tr><td>Siero di cavallo, inattivato termicamente</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Proteina ricombinante GDNF umana</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-10</td><td>Mezzo proencefalico 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Proteina ricombinante BDNF umana/topo/ratto</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-02</td><td>Proencefalo medio 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258148</td><td>Per fare TrisHCl</td></tr><tr><td>ImmEdge (cera) Penna</td><td>Vettoriale Laboraories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di insulina umana</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; I9278</td><td>Proencefalo medio 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Siero di sostituzione knockout</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10828-010</td><td>Proencefalo medio 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Microscopio confocale 980 a scansione laser</td><td>Agarosio Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>a basso punto di fusione,</td> 16520100 <td>Thermo Fisher</td> ultra puro <td>per l'inclusione di hCOs durante il sezionamento del vibratomo</td><td></td></tr><tr><td>Matrice a membrana basale con fattore di crescita ridotto (GFR) Matrigel, senza LDEV</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Per la coltura</td></tr> <tr><td>di organoidiMatrice qualificata Matrigel hESC, senza LDEV</td><td></td><td>Corning 354277</td><td>Per coltura hiPSC</td></tr><tr><td>MgCl2, 1 M</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Microiniettore PicoPump + Interruttore a pedale</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Microloader Puntali per pipette da 0,5 a 20 e micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Per il caricamento di capillari in vetro</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>Integratore di cellule staminali</td></tr><tr><td>N-2 Integratore</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>Forebrain 2 e 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NEB Next Mastermix PCR 2x ad alta fedeltà&nbsp;</td>Camera di conteggio <td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer</td><td>Marca</td><td>718605</td><td></td></tr><tr><td>Medium neurobasale</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Forebrain medium 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11140050</td><td>Terreno del proencefalo 1, 2, 3 e 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Tampone duplex privo di nucleasi Tecnologie</td><td>DNA integrate</td><td>1072570</td><td></td></tr><tr><td>O. C. T. Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Terreno di inclusione per campione di tessuto congelato</td></tr><tr><td>P3 Cellula primaria 4D-Nucleofector X Kit S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Fisher Chemical</td><td>P/0840/53</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way Stampo per inclusione troncatoT12</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986-1</td><td>Per l'inclusione di hCO per vibratomo e criosezione</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Forebrain medium 1, 2, 3 e 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 e per il terreno delle cellule staminali dopo nucleofeczione</td></tr><tr><td>Piastra di Petri 60 mm x 15 mm, senza sfiato, sterile</td><td>Corning</td><td>BP50-02</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri Camera dell'elettrodo in platino, interasse 5 mm</td><td>Apparecchio Harvard BTX</td><td>45-0504</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td> <td>prodotta internamente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td>Da Titrachium album; 10 mg/mL stock</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della via RHO/ROCK (Y-27632)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72232</td><td>Terreno proencefalico 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Citrato di sodio diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio&nbsp;</td><td>Vetrini di adesione Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>SZX10 con un KL 300 LED</td><td>Olympus</td><td>SZX10</td><td>O stereoscopio alternativo</td></tr><tr><td>Thermo Shaker</td><td>Grant bio</td><td>PSC24N</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td>a.k.a. Octoxinol 9</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td>Per fare TrisHCl</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4%</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604021</td><td>Dissociazione enzmye per fare sospensioni unicellulari</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>a.k.a. Polisorbato 20</td></tr><tr><td>Sale di Tyrode</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2145-10x1l</td><td></td></tr><tr><td>Vibrante Microtomo (vibratomo)</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Wide-Bore 1000 &; L Puntali Filtro Universali Corning</td><td></td><td>TF-1005-WB-R-S</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanolo</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21985-023</td><td>Proencefalo medio 1, 3 e 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr></tbody></table>

elettroporazione di organoidi corticali umani affettati per studi di funzione genica

Electroporation of Sliced Human Cortical Organoids for Studies of Gene Function

L'ablazione genica mediata da CRISPR/Cas9 richiede la progettazione di gRNA. Generalmente, il targeting di uno dei primi esoni di un gene di interesse con una coppia di gRNA distanziati di 7-11 bp l'uno dall'altro (evitando multipli di 3 bp) funziona bene (Figura 1A). Come primo test, l'efficienza del riconoscimento del modello da parte dei gRNA può essere interrogata in vitro utilizzando un modello di PCR 26,40,62.</su...

Elettroporazione di organoidi corticali umani affettati per studi di funzione genica

Human cortical organoids have become important tools for studying human brain development, neurodevelopmental disorders, and human brain evolution. ...

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

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