Name: Fenotipizzazione basata sulla purificazione, espansione e citometria a flusso di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo derivate dal topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
Description: Impara un metodo economico per purificare ed espandere cellule staminali mesenchimali del midollo osseo murine. Questo protocollo semplifica l'isolamento e migliora la proliferazione per la ricerca preclinica.

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<ol><li>Chu, D. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+progress+of+isolation%2C+culture%2C+storage%2C+and+clinical+application+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells.</a> Int J Mol Sci. 21 (3), 708(2020).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Transl%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> J Orthop Transl. 3 (1), 26-33 (2015).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+apoptotic+BMSCs+ameliorate+osteoporosis+via+transporting+regenerative+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from apoptotic BMSCs ameliorate osteoporosis via transporting regenerative signals.</a> Theranostics. 14 (9), 3583-3602 (2024).</li>
<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice.</a> J Vis Exp. (131), e56750(2018).</li>
<li>Chu, D. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+stem+cells+for+therapy%3A+An+update+on+the+progress+of+isolation%2C+culture%2C+storage%2C+and+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue stem cells for therapy: An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application.</a> J Clin Med. 8 (7), 917(2019).</li>
<li>Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+fibrotic+diseases%E2%80%94the+two+sides+of+the+same+coin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in fibrotic diseases—the two sides of the same coin.</a> Acta Pharmacol Sin. 44 (2), 268-287 (2023).</li>
<li>Carbone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cervical+dislocation+as+a+humane+euthanasia+method+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> J Vis Exp. (77), e50586(2013).</li>
<li>Grossner, T., Haberkorn, U., Hofmann, J., Gotterbarm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+basal+cell+culture+media+upon+the+osteogenic+response+of+hMSCs+evaluated+by+99mTc-HDP+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of different basal cell culture media upon the osteogenic response of hMSCs evaluated by 99mTc-HDP labeling.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6288(2022).</li>
<li>Janda, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surrogate+Wnt+agonists+that+phenocopy+canonical+Wnt+and+%CE%B2-catenin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surrogate Wnt agonists that phenocopy canonical Wnt and β-catenin signalling.</a> Nature. 545 (7653), 234-237 (2017).</li>
<li>Bernar, A., Gebetsberger, J. V., Bauer, M., Streif, W., Schirmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+Alizarin+Red+S+assay+by+enhancing+mineralization+of+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimization of the Alizarin Red S assay by enhancing mineralization of osteoblasts.</a> Int J Mol Sci. 24 (1), 723(2022).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+osteogenic+differentiation+of+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+mice+inhibited+by+cyclophosphamide+with+psoralen%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Tissue+Eng+Res%22%5BJournal%5D)">Restoration of osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in mice inhibited by cyclophosphamide with psoralen.</a> Chin J Tissue Eng Res. 29 (1), 16-23 (2025).</li>
<li>Papaccio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Cancer+cells%2C+cancer+stem+cells%2C+and+mesenchymal+stem+cells%3A+Influence+in+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Concise review: Cancer cells, cancer stem cells, and mesenchymal stem cells: Influence in cancer development.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2115-2125 (2017).</li>
<li>Kolf, C. M., Cho, E., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells.+Biology+of+adult+mesenchymal+stem+cells%3A+Regulation+of+niche%2C+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: Regulation of niche, self-renewal and differentiation.</a> Arthritis Res Ther. 9 (1), 204(2007).</li>
<li>Soleimani, M., Nadri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).</li>
<li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reliable+protocol+for+long-term+culture+of+murine+bone+marrow+stromal+%28mesenchymal%29+stem+cells+that+retained+their+in+vitro+and+in+vivo+stemness+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal (mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture.</a> Biol Proced Online. 21 (1), 3(2019).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+gene+expression+signatures+associated+with+bone+marrow+stromal+cell+subpopulations+and+time+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals gene expression signatures associated with bone marrow stromal cell subpopulations and time in culture.</a> J Transl Med. 17 (1), 23(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Siringa da 1 ml (ago per siringa da 22 G)</td><td>GRUPPO GENTILE (KDL)</td><td>60017031</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP in 1 passaggio</td><td>Pierce Biotecnologia, Inc.</td><td>34042</td><td>Colorazione con fosfatasi alcalina</td></tr><tr><td>10% formalina tamponata neutra</td><td>Wexis</td><td>5200250</td><td>Fissazione cellulare</td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Selezione del laboratorio</td><td>11110</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Selezione del laboratorio</td><td>11310</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtro cellulare</td><td>Cornig</td><td>352340</td><td>Filtrazione per la rimozione degli agglomerati</td></tr><tr><td>Siringa da 50 ml</td><td>GRUPPO GENTILE (KDL)</td><td>60017040</td><td></td></tr><tr><td>75% di etanolo&nbsp;</td><td>Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd</td><td>31009001</td><td>Disinfettare la pelle dei topi</td></tr><tr><td>Alizarina Rosso S</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Codice: A5533</td><td>Rilevamento di depositi di calcio e noduli calcificati</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale APC CD44 (clone:IM7)</td><td>eBioscience</td><td>17-0441-82</td><td>Citometria a flusso&nbsp;</td></tr><tr><td>Controllo dell'isotipo APC Rat IgG2b kappa (clone:eB149/10H5)</td><td>eBioscience</td><td>17-4031-82</td><td>Citometria a flusso&nbsp;</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Giappone Hiryama Azienda</td><td>HVE-50</td><td>Strumenti chirurgici per sterilizzazione</td></tr><tr><td>Incubatore CO2</td><td>Thermo Fisher Technology (Cina) Co., Ltd.</td><td>300583057</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Flussimetria Cytoflex</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>A00-1-1102</td><td>Citometria a flusso&nbsp;</td></tr><tr><td>desametasone</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D4902</td><td>Differenziazione osteogenica delle BMSC</td></tr><tr><td>Piatto (100mm)</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Piatto (60mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td>Posizionamento del campione durante il trapianto&nbsp;</td></tr><tr><td>Batuffoli di cotone disinfettanti</td><td>Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd.</td><td>20230627</td><td>Disinfettare la pelle dei topi</td></tr><tr><td>Guanti sterili monouso</td><td>Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd</td><td>YT21131</td><td>Funzionamento sterile</td></tr><tr><td>Dieta per roditori irradiati a doppio leone</td><td>Suzhou Shuangshi Sperimentale Tecnologia per l'Alimentazione Animale Co., Ltd.</td><td>GB 14924.3</td><td>Mangimi</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Shanghai Biosun Sci& Fornitore verificato - Tech Co., Ltd.</td><td>BS-0002-500</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>FITC Criceto Anti-Rat CD29 (clone:Ha2/5)</td><td>BD Bioscienze</td><td>555003</td><td>Citometria a flusso&nbsp;</td></tr><tr><td>FITC Criceto IgM, &lambda; 1 Controllo isotipo (clone: G235-1)</td><td>BD Bioscienze</td><td>553960</td><td>Citometria a flusso&nbsp;</td></tr><tr><td>gelatina (0,1%)</td><td>OriCell</td><td>GLT-11301</td><td>migliorare la capacità di adesione delle cellule</td></tr><tr><td>IVC gabbia per topi</td><td>Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.</td><td>HH-MMB-2</td><td>Barriera per animali</td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Codice: A8960</td><td>Differenziazione osteogenica delle BMSC</td></tr><tr><td>Segna penna</td><td>Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.</td><td>YYST5</td><td>Contrassegnare le informazioni cellulari sulla capsula di Petri</td></tr><tr><td>Modifica MEM Alpha (1X)</td><td>Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd</td><td>SH30265</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Kit di differenziazione adipogenica delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo di topo</td><td>Ciageno</td><td>MUXMX-90031</td><td>Differenziazione adipogenica delle BMSC&nbsp;</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti2 Microscopio invertito Synstem</td><td>Giappone Nikon Corporatin</td><td>Ti2-U</td><td>Osserva le celle e scatta foto</td></tr><tr><td>Forbici oftalmiche&nbsp;</td><td>Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd</td><td>Y00030 JZ</td><td>Taglia la pelle</td></tr><tr><td>Pinzette oftalmiche</td><td>Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd</td><td>BS-ZER-S-100 Biosharp</td><td>Procurarsi del tessuto osseo di topo.</td></tr><tr><td>PIPETTA PASTEUR</td><td>Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd</td><td>BS-XG-03M</td><td>Aspirare il terreno di coltura</td></tr><tr><td>PE Rat Anti-Mouse CD31 (clone: Ha2/5)</td><td>BD Bioscienze</td><td>553373</td><td>Citometria a flusso&nbsp;</td></tr><tr><td>PE Ratto IgG2a, &kappa; Controllo isotipo (clone:R35-95)</td><td>BD Bioscienze</td><td>553930</td><td>Citometria a flusso&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale PE-Cianina7 Ly-6A/E (Sca-1) (clone:D7)</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-82</td><td>Citometria a flusso&nbsp;</td></tr><tr><td>PE-Cianina7 Rat IgG2a kappa Controllo dell'isotipo (clone: eBR2a)</td><td>eBioscience</td><td>25-4321-82</td><td>Citometria a flusso&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd</td><td>2585636</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 (clone: Ha2/5)</td><td>BD Bioscienze</td><td>561869</td><td>Citometria a flusso&nbsp;</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 IgG2b di ratto, &kappa; Controllo isotipo (clone:A95-1)</td><td>BD Bioscienze</td><td>550764</td><td>Citometria a flusso&nbsp;</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Fabbrica di strumenti chirurgici oDispositivi medici di Shanghai? Gruppo?Co., Ltd.</td><td>J11010-10# JZ</td><td>Isolare gli arti posteriori e il busto del topo e rimuovere i tessuti estranei dall'osso</td></tr><tr><td>Cappuccio sterile</td><td>Thermo Fisher Technology (Cina) Co., Ltd.</td><td>ECO0.9</td><td>Tavolo operatorio chirurgico</td></tr><tr><td>teli chirurgici sterili</td><td>Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.</td><td>20160900</td><td>Fornire un'area chirurgica sterile</td></tr><tr><td>Provetta (50 mL)</td><td>Shanghai Baisai, Biotecnologia Co., Ltd.</td><td>BLD-BL2002500</td><td>Conservare la soluzione cellulare filtrata</td></tr><tr><td>tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>digerire le cellule aderenti</td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G5422</td><td>Differenziazione osteogenica delle BMSC</td></tr></tbody></table>

fenotipizzazione basata sulla purificazione, espansione e citometria a flusso di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo derivate dal topo

Purification, Expansion, and Flow Cytometry-Based Phenotyping of Mouse Derived Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Le BMSC derivate dal topo sono state isolate e coltivate per circa 2 settimane per generare le BMSC del terzo passaggio (P3) (Figura 3). Come mostrato nella Figura 3A, le cellule appena estratte dal midollo osseo sono rimaste mononucleate con goccioline di grasso visibili. Le cellule a forma di fuso sono apparse nel piatto di coltura, raggiungendo una confluenza del 60%-80% il 5° giorno di coltura (<strong class="xfig"...

Fenotipizzazione basata sulla purificazione, espansione e citometria a flusso di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo derivate dal topo

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of stem cells that can self-renew and differentiate into multiple cell lineages. Among them, MSCs found in ...

purification-expansion-flow-cytometry-based-phenotyping-mouse-derived

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Biologia

Un metodo per analizzare la distribuzione di progenitori midollari ematopoietiche citometria di flusso e per isolare in modo efficiente altamente purificate cellule staminali ematopoietiche (CSE) è descritto. La procedura di isolamento è essenzialmente basata su un arricchimento magnetico di c-kit + e le cellule di separazione delle cellule per purificare CSE per studi cellulari e molecolari.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

Si descrive un protocollo per l'isolamento e la purificazione di neutrofili dal midollo osseo di topo per centrifugazione in gradiente di densità e di etichettatura neutrofili utilizzando coloranti CellTracker. Questo rappresenta un metodo semplice e veloce, riproducibile ed economico per ottenere un gran numero di neutrofili per studi funzionali a valle o di trasferimento ed inseguimento esperimenti adottive.

Isolamento, la purificazione e della dicitura del mouse Bone Marrow neutrofili per studi funzionali ed Esperienze trasferimento adottivo

Descriviamo un protocollo per rilevare l'espressione simultanea di marcatori di cellule staminali leucemia sulle cellule di leucemia mieloide acuta primaria tramite flusso cytometry. Vi mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici e una popolazione di LSC putativa con crescente grado di maturazione. Abbiamo confermato la presenza di queste popolazioni in corrispondente paziente-derivato-xenotrapianti.

Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up

La diagnosi MDS è difficile in assenza di criteri morfologici o citogenetica non informativo. MFC potrebbe contribuire ad affinare il processo diagnostico MDS. Per diventare utile per la pratica clinica, l'analisi MFC deve basarsi su parametri con sufficiente sensibilità e specificità, e i dati devono essere riproducibili tra operatori diversi.

Citometria di flusso di database-Guida per la valutazione della maturazione delle cellule mieloidi del midollo osseo

Dimostriamo come identificare e isolare 6 sottoinsiemi dei progenitori mieloidi dal midollo osseo murino utilizzando una combinazione di magnetico e fluorescenza ordinamento (MACS e FACS). Questo protocollo può essere usato per analisi di RNA/proteine, in vivo gli esperimenti di trasferimento adottivo e saggi di cultura in vitro (colture di metilcellulosa o liquido).

Identificazione e isolamento di Oligopotent e dei progenitori mieloidi Lineage-commesso dal midollo osseo del topo

Le pompe di efflusso xenobiotico sono altamente attive nelle cellule staminali esemiche e progenitrici (HSPC) e causano l'estrusione di TMRM, una membrana mitocondriale potenziale disfunzione fluorescente. Qui, presentiamo un protocollo per misurare con precisione il potenziale della membrana mitocondriale negli HSPC da TMRM in presenza di Verapamil, un inibitore della pompa di efflusso.

Migliorare l'accuratezza del flusso Valutazione citometrica del potenziale della membrana mitocondriale nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici attraverso l'inibizione delle pompe di efflusso

Questo metodo descrive la purificazione mediante citometria a flusso di MEP e MKp da topi femori, tibie e ossa pelviche.

Isolamento dei progenitori dei megacariociti di topo

Qui, descriviamo un semplice protocollo per l'isolamento e la colorazione delle cellule del midollo osseo murino al fenotipo delle cellule staminali emopoietiche e progenitrici insieme alle cellule staminali endoteliali e mesenchimali di nicchia di supporto. È incluso anche un metodo per arricchire le cellule situate nelle aree endostali e centrali del midollo osseo.

Analisi citometrica a flusso di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche del midollo osseo murino e cellule di nicchia stromale

Questo protocollo descrive l'uso della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza di cellule staminali mesenchimali umane utilizzando il metodo di selezione a singola cellula. In particolare, l'uso del sorting a singola cellula può raggiungere una purezza del 99% delle cellule immunofenotipizzate da una popolazione eterogenea se combinato con un approccio basato sulla citometria a flusso multiparametrica.

Ordinamento a singola cellula di cellule staminali mesenchimali immunofenotipizzate da denti decidui esfoliati umani

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per isolare e caratterizzare le popolazioni microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindromi mielodisplastiche e leucemia mieloide acuta. Questa tecnica identifica i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo non ematopoietico, comprese le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, con progressione della malattia.

Identificazione delle popolazioni microambientali del midollo osseo nella sindrome mielodisplastica e nella leucemia mieloide acuta

Impara un metodo economico per purificare ed espandere cellule staminali mesenchimali del midollo osseo murine. Questo protocollo semplifica l'isolamento e migliora la proliferazione per la ricerca preclinica.

Fenotipizzazione basata sulla purificazione, espansione e citometria a flusso di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo derivate dal topo (Video) | JoVE Journal

Fenotipizzazione basata sulla purificazione, espansione e citometria a flusso di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo derivate dal topo

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