Valutazione della segnalazione della morte cellulare mediante immunofluorescenza in un modello di ictus ischemico di ratto

L'ictus ischemico è la principale causa di morte e disabilità in tutto il mondo. Il nostro lavoro si concentra sui bersagli farmacologici per l'ictus. Siamo interessati a diversi target emergenti, come RUNX1 e le catepsine. Per valutare questi obiettivi, abbiamo sviluppato un modello di ictus ischemico nel ratto occludendo l'arteria cerebrale media.

Modelliamo l'ictus ischemico nei ratti inserendo un filamento per occludere l'arteria cerebrale media. Il modello di occlusione dell'arteria cerebrale media è il modello di roditore più comunemente usato per gli studi preclinici sull'ictus combinati con altre tecniche, come la TTC, l'immunofluorescenza e la colorazione TUNEL. Possiamo esplorare la fisiopatologia dell'ictus in un approccio integrato. Ci sono alcune sfide tecniche per l'immunofluorescenza, come la specificità degli anticorpi che riducono al minimo il fondo di fluorescenza e l'ottimizzazione del rapporto segnale/rumore sfruttando le proprietà delle etichette fluorescenti e degli anticorpi specifici. L'immunofluorescenza ci permette di comprendere l'intricato panorama dell'architettura cellulare e le interazioni molecolari con il modello di occlusione dell'arteria cerebrale media.

Un certo numero di tessuto cerebrale è potenzialmente recuperabile con un'appropriata finestra temporale dell'ictus. I nostri risultati mostrano che l'espressione della catepsina B è attivata nel numero di cervelli di ratto dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale media. È accompagnato da un aumento dell'apoptosi. Ulteriori studi sul meccanismo alla base della segnalazione della morte cellulare potrebbero fornire nuovi bersagli per il farmaco.

Nel nostro studio futuro, continueremo a esplorare potenziali bersagli molecolari nelle vie infiammatorie e nella segnalazione della morte cellulare. Speriamo che alcuni di questi obiettivi scoperti da studi sperimentali possano essere tradotti in terapia clinica, migliorando così la sopravvivenza e la qualità della vita dei pazienti colpiti da ictus.

[Narratore] Per iniziare, posizionare il ratto anestetizzato in posizione supina e mantenere la sua temperatura corporea a 36,5 °C utilizzando un tappetino termico regolato e una sonda per il monitoraggio della temperatura rettale. Radere la pelle del collo e disinfettarla con una soluzione disinfettante iodophor. Successivamente, praticare un'incisione della linea mediana di 2 cm nel collo e ritrarre i tessuti molli per esporre i vasi carotidee. Usando una pinza, isolare l'arteria carotide comune destra, o CCA, l'arteria carotide esterna, ECA, e l'arteria carotide interna, ICA. Legare il CCA prossimale destro utilizzando suture. Quindi bloccare l'ICA e l'ECA giusti all'origine con una microclip. Inserire un monofilamento di nylon rivestito con una punta rotonda in silicone nel lume del CCA attraverso una piccola incisione e fare un nodo nel CCA per evitare il sanguinamento e lo spostamento del monofilamento. Aprire la microclip ICA destra e inserire il monofilamento nell'arteria cerebrale media destra, o MCA, attraverso il moncone ICA fino a quando la punta in silicone non occlude l'origine dell'MCA. Tagliare la parte esposta del monofilamento di nylon e chiudere l'incisione del collo della linea mediana. Dopo due ore di occlusione MCA, aprire l'incisione del collo e sciogliere il nodo nel CCA. Quindi estrarre il monofilamento di nylon per riperfondere l'MCA. Dopo l'intervento chirurgico, osservare il ratto durante il recupero dall'anestesia in una gabbia riscaldata mantenuta con un tappetino riscaldante a temperatura regolata. Utilizzando la Zaya Long Behavioral Rating Scale, valutare la funzione neurologica a due ore dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale media, o MCAO, e 22 ore dopo la riperfusione. Dopo aver isolato l'intero cervello dal ratto modello MCAO, congelare il cervello a -20 °C per 20 minuti. Tagliare il cervello congelato in sei fette coronali con una distanza di 2 mm tra le fette. Colorare le fette con il 2% di TTC per 15 minuti a 37 °C al buio. Quindi fissare le fette di cervello con paraformaldeide al 4% per 24 ore a temperatura ambiente. Fotografa le fette macchiate utilizzando una fotocamera digitale impostata sulla modalità automatica per gli oggetti in primo piano. Trasferisci le immagini su un computer e utilizza il software ImageJ per misurare la dimensione dell'infarto. Calcola la dimensione dell'infarto come il rapporto tra la somma dell'area dell'infarto in tutte e sei le fette e la somma dell'area cerebrale totale nelle stesse fette. Nel gruppo MCAO sono state osservate aree di infarto significative rispetto a nessun infarto nel gruppo sham. Per l'analisi dell'immunofluorescenza, fissare il cervello intatto del ratto modello MCAO in paraformaldeide al 4% per 24 ore. Quindi disidratare il cervello in una serie di gradienti di soluzione di saccarosio a concentrazioni del 10%, 15% e 30%, a concentrazioni del 10%, 15% e 30%, continuando fino a quando il tessuto affonda. Incorporare il cervello disidratato nel composto a temperatura di taglio ottimale e rimuovere eventuali bolle d'aria. Snap congelare il cervello in azoto liquido. Su un criostato, sezionare il cervello a uno spessore di 5 μm. Dopo aver equilibrato le sezioni cerebrali congelate a temperatura ambiente, lavarle tre volte con PBS sterile per 5 minuti ciascuna. Delineare il tessuto con una penna immunoistochimica prima di incubare con 20 μg per mL di proteinasi K e Triton X-100 allo 0,3% a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo aver lavato le sezioni con PBS, applicare il 3% di BSA sul tessuto delineato e incubare a temperatura ambiente per un'ora per il blocco. Sostituire la soluzione bloccante con l'anticorpo primario appropriato e incubare le sezioni per una notte al buio a 4 °C. Il giorno successivo, lavare le sezioni tre volte con PBS sterile contenente lo 0,1% di Tween-20 per 5 minuti ciascuna. Aggiungere l'anticorpo secondario appropriato coniugato al fluoroforo richiesto e incubare le sezioni in una camera umidificata per un'ora, proteggendole dalla luce. Dopo aver lavato le sezioni con PBS contenente Tween-20, colorarle con un mezzo di montaggio contenente DAPPI e coprire con vetrini coprioggetto. Su un microscopio a fluorescenza, impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 488 nm, la lunghezza d'onda di emissione a 520 nm e il tempo di esposizione a 500 ms per catturare la sezione del cervello colorataEtà. L'immunoreattività della catepsina B è risultata significativamente aumentata nel nucleo ischemico del gruppo MCAO rispetto al gruppo sham. L'immunoreattività della catepsina B era significativamente elevata nella corteccia della penombra del gruppo MCAO rispetto al gruppo sham. Non è stata osservata alcuna differenza significativa nell'immunoreattività della catepsina B tra il nucleo ischemico e la corteccia penombrale. Per iniziare, disidratare le fette di cervello fissate con paraformaldeide dal ratto modello MCAO in una concentrazione crescente di etanolo per 35-50 minuti ciascuna. Quindi trattare le fette di cervello con l'agente biologico trasparente 1 del tipo olio di trementina per 35-50 minuti, seguito dall'agente di pulizia 2 per 35-50 minuti fino a quando il tessuto non è completamente trasparente. Ora immergi le fette di cervello nei mezzi di incorporamento 1, 2, 3 e 4 in sequenza per 60 minuti ciascuno. Metti le fette di cervello in una cassetta di inclusione, sigillale ermeticamente e conservale in una cella frigorifera per la solidificazione. Utilizzando il microtomo, tagliare il blocco di tessuto a 10 μm, quindi affettare a 5 μm. Lasciare galleggiare le sezioni di tessuto a bagnomaria a 45 °C per 30 secondi e poi trasferirle su vetrini. Dopo l'essiccazione, deparaffinare le sezioni cerebrali in un agente schiarente per due cicli di 10 minuti ciascuno. Quindi reidratare le sezioni cerebrali in concentrazioni decrescenti di etanolo. Ora risciacquare la sezione tre volte in PBS per cinque minuti ciascuna. Dopo aver rimosso l'umidità in eccesso, aggiungere 100 μL di proteinasi K a ciascuna sezione e incubare a 37 °C per 20 minuti. Dopo i lavaggi con PBS, applicare 100 μL di tampone di equilibrio deossinucleotidiltransferasi terminale su ciascun campione e incubare in una camera umidificata a 37 °C per 10-30 minuti. Rimuovere il tampone utilizzando carta assorbente e aggiungere 50 μl di soluzione di lavoro per la marcatura dal kit di analisi TUNEL. Successivamente, applicare la soluzione di lavoro DAPPI sulle sezioni e incubare al buio per cinque minuti per controcolorare i nuclei. Sciacquare i campioni in PBS quattro volte per 5 minuti ciascuno. Rimuovere il liquido in eccesso e sigillare la diapositiva con un mezzo di montaggio anti-sbiadimento. Scansiona il vetrino colorato utilizzando il sistema di imaging multispettrale Vectra Polaris. La colorazione TUNEL ha mostrato un aumento significativo dell'apoptosi, con più cellule TUNEL-positive nella corteccia penombrale del gruppo MCAO rispetto al gruppo sham.