Name: Imaging e quantificazione della morfologia mitocondriale in C. elegans durante linvecchiamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Impara a eseguire imaging e quantificazione della morfologia mitocondriale in C. elegans durante l'invecchiamento. Questo metodo standardizzato utilizza microscopia confocale e wide field per analizzare i cambiamenti tessuto-specifici.

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<meta charset="utf8"></head><body>Analisi della morfologia mitocondriale in C. elegans

<table><tbody><tr><td>5-fluoro-2'-deossiuridina (FUDR)</td><td>Spectrum Chemical</td><td>F2026-10GMBL</td><td>per l'inibizione della proliferazione</td></tr><tr><td>APEX IPTG</td><td>Genesee</td><td>18-242</td><td>per RNAi</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>90000-764</td><td>per piastre NGM</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR</td><td>97064-330</td><td>per piastre NGM</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>per lastre NGM</td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>VWR</td><td>76345-522</td><td>per colesterolo RNAi</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>80057-932</td><td>per piastre NGM</td></tr><tr><td>Microscopio confocale&nbsp;</td><td>Solvente Stellaris 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td>per farmaci</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio HistoBond</td><td>VWR</td><td>16005-110</td><td>per preparazione di vetrini</td></tr><tr><td>LB Brodo</td><td>VWR</td><td>95020-778</td><td>per</td></tr><tr><td>cannocchiale da dissezione LB LEICA S7E Leica</td><td></td><td>10450840</td><td>Microscopio da dissezione standard</td></tr><tr><td>LEICA STELLARIS 5</td><td>Leica</td><td>158101100</td><td>Microscopio confocale</td></tr><tr><td>LEICA THUNDER</td><td>Leica</td><td>11525679</td><td>Compound Microscopio</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>VWR</td><td>97062-132</td><td>per piastre NGM,</td></tr><tr><td>M9 pL4440 plasmide vettoriale vuoto</td><td>addgene</td><td>plasmide #1654</td><td>per plasmide vettoriale vuoto</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>VWR</td><td>97061-566</td><td>per soluzione candeggina</td></tr><tr><td>Potassio fosfato bibasico</td><td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>per piastre NGM</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>per M9</td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>per paralizzanti vermi</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>VWR</td><td>EM-SX0420-5</td><td>per piastre NGM, M9</td></tr><tr><td>Ipoclorito di sodio</td><td>VWR</td><td>RC7495.7-32</td><td>per soluzione</td></tr> <tr><td>di candegginaFosfato di sodio bibasico</td><td>VWR</td><td>71003-472</td><td>per M9</td></tr><tr><td>Tetraciclina cloridrato</td><td>VWR</td><td>97061-638</td><td>per RNAi</td></tr><tr><td>WOB-L&non; &AElig; Pompe per vuoto a secco, per impieghi standard, Welch&not; &AElig;</td><td>VWR</td><td>80077-612</td><td>per aspirazione</td></tr></tbody></table>

imaging e quantificazione della morfologia mitocondriale in c. elegans durante l'invecchiamento

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans During Aging

C. elegans è un ottimo modello per l'imaging mitocondriale grazie al suo corpo trasparente, che consente un facile imaging di vermi interi e animali vivi senza un'eccessiva preparazione del campione. Inoltre, la morfologia mitocondriale in diversi tessuti può essere facilmente visualizzata utilizzando promotori tessuto-specifici per esprimere proteine fluorescenti mirate ai mitocondri. Qui, myo-3p (per i mitocondri muscolari), vha-6p (per i mitocondri intestinali) e col-19p (per i mitocondri ipodermici) sono stati utilizzati per guidare l'espressione di una GFP (sequenza di localizzazione mitocondriale della proteina ATP-1) mirata ai mitocondri. I mitocondri dei muscoli della parete corporea di C. elegans mostrano una morfologia tubulare, allineandosi lungo le fibre muscolari (miofibrille) (Figura 1A); i mitocondri intestinali mostravano strutture altamente interconnesse, simili a ragnatele, con un allineamento meno uniforme (Figura 1B); e l'ipoderma ha mitocondri tubulari che appaiono più arrotondati o di forma ovale rispetto all'intestino o al muscolo (Figura 1C). La morfologia mitocondriale è generalmente coerente per tutta la lunghezza del verme nel muscolo e nell'intestino, ma l'ipoderma mostra alcune differenze minori nell'interconnessione dei mitocondri tra le estremità prossimale e distale del verme. Pertanto, per ottenere risultati sperimentali riproducibili, si consiglia di concentrarsi su una regione specifica del loro corpo. Qui, l'area tra la faringe e la vulva ~100-200 μm sotto la faringe è costantemente visualizzata.
Per i mitocondri muscolari e ipodermici, l'imaging al microscopio composto fornisce una risoluzione sufficiente a causa della piattezza delle cellule e dei bassi livelli di luce sfocata. Tuttavia, i mitocondri intestinali sono difficili da osservare con un microscopio composto, poiché il grande volume dell'intestino limita la risoluzione a causa di una grande quantità di luce sfocata proveniente da altre sezioni dell'intestino (Figura 2). Pertanto, si consiglia di visualizzare i mitocondri intestinali con un microscopio confocale per ridurre la luce sfocata e visualizzare la corretta morfologia mitocondriale.
La forma dei mitocondri è altamente dinamica e cambia in base all'ambiente metabolico degli animali23 o anche a causa dell'esposizione a rigidezze variabili del substrato24. Pertanto, lasciare gli animali sui vetrini del microscopio per lunghi periodi di tempo in assenza di una fonte di cibo e sul substrato rigido di vetro può potenzialmente influire sulla morfologia mitocondriale. Qui, questo studio ha scoperto che i mitocondri dei vermi si frammentano dopo circa 30 minuti su un vetrino in soluzione M9, con i mitocondri ipodermici che mostrano la maggiore frammentazione (Figura 3). Pertanto, l'imaging dei mitocondri deve essere eseguito rapidamente dopo la preparazione del campione.
Le sostanze chimiche che limitano la mobilità dei vermi, tra cui l'azide di sodio e il tetramisolo, sono comunemente utilizzate per l'imaging dal vivo di C. elegans, poiché i vermi stazionari sono necessari per catturare più sezioni z di animali per l'imaging 3D. Studi precedenti hanno dimostrato che l'esposizione all'azide di sodio o al tetramisolo può provocare la frammentazione mitocondriale25. Sorprendentemente, è stato scoperto che l'azide di sodio, anche ad alte concentrazioni, ha un impatto limitato sulla morfologia mitocondriale nel muscolo o nell'intestino. Tuttavia, l'ipoderma mostrava una frammentazione mitocondriale più precoce rispetto ai controlli M9 (Figura 3). È importante sottolineare che alte concentrazioni di tetramisolo (100 mM) hanno provocato una significativa frammentazione mitocondriale subito dopo l'esposizione in tutti i tipi di cellule. In confronto, le concentrazioni medie (10 mM) hanno portato a una frammentazione più rapida rispetto a un controllo M9. Basse concentrazioni (1 mM) hanno avuto un impatto limitato sulla morfologia mitocondriale. Questi dati suggeriscono che l'utilizzo dell'azide di sodio può essere un'opzione praticabile per l'imaging rapido dei mitocondri, mentre il tetramisolo dovrebbe essere generalmente evitato.
Come previsto, i mitocondri di tutti i tessuti di C. elegans mostrano frammentazione durante il naturale processo di invecchiamento (Figura 4A). La frammentazione può essere visualizzata come mitocondri che si presentano come strutture più tronche e sferiche, che sono notevolmente diverse dai mitocondri lineari e tubolari mostrati negli animali giovani. È importante notare che l'intestino aumenta nelle strutture sferiche autofluorescenti in età avanzata, quindi è necessario prestare attenzione a non confondere l'autofluorescenza con le strutture mitocondriali effettive. Poiché può esserci variabilità dei cambiamenti nella struttura mitocondriale tra i vermi, è importante eseguire la quantificazione della morfologia mitocondriale su un campione di dimensioni significative piuttosto che limitarsi a visualizzare alcuni vermi. In questo caso è stato utilizzato mitoMAPR, che consente la quantificazione automatizzata della morfologia mitocondriale utilizzando un insieme diversificato di metriche, tra cui oggetti, reti, giunzioni per rete, punti di giunzione, lunghezza dell'oggetto, impronta mitocondriale, copertura mitocondriale e area dell'oggetto (Tabella supplementare 1 e Tabella supplementare 2). L'automazione elimina i pregiudizi soggettivi dall'utente. Qui, riportiamo che la metrica della lunghezza dell'oggetto è ottimale per misurare quantitativamente i cambiamenti nella morfologia mitocondriale muscolare e intestinale durante l'invecchiamento e le metriche dei punti di giunzione per misurare i cambiamenti nella morfologia mitocondriale ipodermica durante l'invecchiamento (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig01.jpg"> 
Figura 1: Immagini dei mitocondri in tutto il corpo di C. elegans. L'imaging mitocondriale è stato eseguito per l'intera durata del giorno 5 animali adulti cresciuti in EV dallo stadio L1 in animali transgenici con espressione di MLS::GFP nel muscolo (A), nell'intestino (B) e nell'ipoderma (C). Barra di scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig02.jpg"> 
Figura 2: Confronto dell'imaging mitocondriale tra microscopio composto e microscopio confocale. L'imaging mitocondriale è stato eseguito in animali adulti al giorno 1 cresciuti in EV dallo stadio L1 in animali transgenici con espressione di MLS::GFP nel muscolo (A), nell'intestino (B) e nell'ipoderma (C). Barra di scala: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig03.jpg"> 
Figura 3: Valutazione della frammentazione mitocondriale di diversi tessuti dopo il trattamento con M9, azoturo di sodio e tetramisolo. L'imaging mitocondriale è stato eseguito in animali adulti al giorno 1 con espressione di MLS::GFP nel muscolo, nell'intestino e nell'ipoderma. Gli animali sono stati allevati con EV a partire dallo stadio L1. Gli animali sono stati posizionati su vetrini contenenti M9, azoturo di sodio (1 mM, 10 mM e 100 mM) o tetramisolo (1 mM, 10 mM e 100 mM) e l'imaging è stato eseguito immediatamente dopo la preparazione del vetrino (0 min) o 15 min o 30 min dopo la preparazione del vetrino. Immagini rappresentative sono mostrate per n &gt; 5 animali per ceppo per 2 repliche biologiche. Barre di scala: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig04.jpg"> 
Figura 4: Imaging mitocondriale di C. elegans durante l'invecchiamento in diversi tessuti e quantificazione della morfologia mitocondriale utilizzando MitoMAPR. (A) L'imaging mitocondriale è stato eseguito in animali adulti nei giorni 1, 5, 9, 13 e 15 dell'età adulta con espressione di MLS::GFP nel muscolo, nell'intestino e nell'ipoderma. Gli animali sono stati allevati con EV dallo stadio L1 e spostati su piastre EV contenenti FUDR dallo stadio adulto del giorno 1. Le immagini sono rappresentative di n ≥ 5 animali per ceppo per ≥ 3 repliche biologiche. Barra di scala: 5 μm. (B) La quantificazione della lunghezza dell'oggetto dei mitocondri muscolari e intestinali dei vermi nei giorni 1, 5, 9, 13 e 15 e la quantificazione dei punti di giunzione dei mitocondri ipodermici dei vermi nei giorni 1, 5, 9, 13 e 15. Tutti i singoli punti dati combinati con la media ± SD. I grafici sono stati tracciati e analizzati statisticamente utilizzando un test t di Student. ns = non significativo, *p &lt; 0,03; **p &lt; 0,002; p &lt; 0,0002; p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Giorni di vermi</td>
			<td>Numero di vermi</td>
			<td>Volume del tampone (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Numero raccomandato di worm e volumi di buffer durante la preparazione dei vetrini.
Figura 1 supplementare: Flussi di lavoro dell'applicazione di una quantificazione di una singola immagine utilizzando MitoMAPR e l'elaborazione batch per più immagini. (A) Flusso di lavoro per quantificare la morfologia mitocondriale da una singola immagine utilizzando la macro MitoMAPR. (B) Proiezione Z di file di immagine 3D grezza utilizzando Fiji (proiezione massima). (C) Ritaglio della regione di interesse dall'immagine Z proiettata. (D) Immagini dello Skeletor acquisite dalla macro MitoMAPR. Barre di scala: 5 μm. (E) Flusso di lavoro per quantificare la morfologia mitocondriale da più immagini utilizzando il processo batch utilizzando la macro MitoMAPR. (F) Screenshot della macro di ritaglio. (G) Screenshot di un processo batch per la proiezione Z. (H) Screenshot della finestra di conferma della selezione della macro di ritaglio batch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare 1: Analisi quantitativa delle metriche della morfologia mitocondriale nel tessuto muscolare di C. elegans . Le metriche registrate includono oggetti, reti, giunzioni per rete, punti di giunzione, lunghezza dell'oggetto, impronta mitocondriale, area dell'oggetto e copertura mitocondriale, misurate in giorni diversi. I dati forniscono una base per valutare i cambiamenti nella morfologia mitocondriale con l'invecchiamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare 2: Effetti delle sostanze chimiche immobilizzanti sulla morfologia mitocondriale in C. elegans. I dati includono misurazioni come oggetti, reti, giunzioni per rete, punti di giunzione, lunghezza dell'oggetto, impronta mitocondriale, area dell'oggetto e copertura mitocondriale in concentrazioni e punti temporali variabili dopo la preparazione del campione con tampone M9 o diverse concentrazioni di tetramsolo e sodio azide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Imaging e quantificazione della morfologia mitocondriale in C. elegans durante l'invecchiamento

Mitochondria, important cellular organelles found in most eukaryotic cells, are major sites of energy production through aerobic respiration. Beyond this ...

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