Imaging e quantificazione della morfologia mitocondriale in C. elegans durante l'invecchiamento

Questo protocollo fornisce un approccio standardizzato per l'imaging e la quantificazione dei cambiamenti nella morfologia mitocondriale in più tessuti. Nell'eleganza C, la morfologia mitocondriale è spesso associata alla sua funzionalità. I cambiamenti nella morfologia mitocondriale possono essere osservati in varie condizioni di malattia e con la progressione dell'invecchiamento, che spesso sono correlati con la disregolazione della funzione mitocondriale, Diversi tessuti e vedere eleganza.

Presentano strutture mitocondriali uniche che richiedono strategie di imaging distinte. Pertanto, la selezione di un microscopio appropriato e l'ottimizzazione della preparazione del campione sono essenziali per il successo dell'imaging tissutale specifico dei mitocondri e del C Elegance. Qui abbiamo scelto di utilizzare i ceppi di cele transgenici che esprimono GFP localizzata nei mitocondri invece dei coloranti mitocondriali convenzionali.

Questo ci permette di evitare gli effetti fuori bersaglio, la bipenetranza onale e le complesse fasi di preparazione del campione necessarie per visualizzare i mitocondri in diversi tessuti utilizzando un colorante. L'obiettivo principale del nostro laboratorio è lo studio dell'omeostasi mitocondriale durante lo stress e l'invecchiamento. La standardizzazione di un protocollo di imaging mitocondriale è essenziale per ridurre al minimo gli errori extramentali e generare risultati riproducibili per quanto riguarda i cambiamenti nella morfologia mitocondriale in varie condizioni biologiche.

Per iniziare, procurati vetrini puliti. Per la preparazione del campione, aggiungere da 10 a 20 microlitri di soluzione di M nove sul vetrino e posizionare il numero desiderato di vermi adulti a età specifiche nella soluzione. Sul vetrino, coprire i vermi nella soluzione M nine con un vetro di copertura per visualizzare il muscolo.

Mitocondri, spingere il vetrino coprioggetto per arrotolare i vermi. Quindi con uno smalto sigillare i lati del vetro di copertura per evitare l'evaporazione della soluzione M nine. Utilizzare un microscopio a campo largo standard per visualizzare i mitocondri muscolari ed epidermici che esprimono i tag fluorescenti.

Utilizzare un microscopio confocale per l'imaging dei mitocondri intestinali e ottimizzare le impostazioni di imaging per adattarle alla specifica configurazione sperimentale. Per iniziare l'analisi, apri l'applicazione Fiji dopo l'installazione per scaricare e installare la macro mito mapper. Innanzitutto, scarica quello del codice sorgente.

Copiare il codice elencato in Un codice IJM per MIT mapper 1.0. Apri Fiji e vai su plugin, seguito da nuovo e macro incolla il codice copiato nella finestra della macro. Quindi salva la macro per un uso futuro tramite file e salva con nome.

Passa al file, quindi apri per aprire un'immagine microscopica 3D con Zs.In Fiji, crea una proiezione massima sotto l'immagine, seguita da pile e progetto Z. Seleziona l'intervallo di sezioni all'interno delle immagini a fuoco per la massima proiezione e scegli l'intensità massima come tipo di proiezione per salvare l'immagine massima proiettata. Come tiff, vai su file e fai clic su Salva con nome seguito da tiff.

Ritaglia le regioni di interesse dall'intera immagine con lo strumento rettangolo e vai all'immagine e al ritaglio. Vai su file seguito da salva con nome e tiff per salvare l'immagine ritagliata in formato Tiff. Trascina e rilascia la mappa mito o il file macro precedentemente salvato sulla barra degli strumenti delle Figi.

Fare clic su Esegui. Quando richiesto, selezionare la cartella contenente il file TIFF salvato nel passaggio precedente. Quando viene richiesto di selezionare un'area, creare un rettangolo nell'immagine utilizzando lo strumento rettangolo e premere OK per confermare.

Infine, vai su file e salva i dati con tutti i valori relativi alla morfologia mitocondriale come file CSV a punti. La morfologia mitocondriale era tessuto-specifica, con mitocondri tubulari che si allineavano con le fibre muscolari nei muscoli, interconnesse, strutture simili a ragnatele nell'intestino e più arrotondate o ovali. L'imaging dei mitocondri nell'ipoderma con un microscopio confocale ha migliorato la visualizzazione dei mitocondri intestinali riducendo la luce sfocata rispetto alla microscopia composta.

Sui vetrini, i mitocondri mostravano frammentazione dopo 30 minuti nel tampone M nine con i mitocondri epidermici che mostravano la frammentazione più prominente. L'invecchiamento ha provocato la frammentazione mitocondriale in tutti i tessuti, che appaiono come strutture tronche e sferiche. La quantificazione del mappatore del MIT ha indicato che la lunghezza dell'oggetto cambiava nei muscoli e il punto di giunzione cambiava nell'ipoderma.