Imaging al microscopio a epifluorescenza time-lapse di fenotipi eterogenei di Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus

La ricerca del nostro laboratorio si concentra sul motivo per cui gli antibiotici falliscono. In particolare, siamo interessati alle poche cellule chiamate persistenti nelle popolazioni batteriche che si suppone vengano uccise dall'antibiotico, ma che possono sopravvivere al trattamento antibiotico. E si pensa che questi persistenti causino una ricaduta delle infezioni dopo la fine del trattamento antibiotico.

Quindi siamo interessati a esaminare l'espressione genica e il metabolismo di questi persistenti per comprendere meglio le loro strategie di sopravvivenza. La sfida attuale per il campo dei persister è quella di bilanciare il throughput con la sensibilità delle singole cellule. Abbiamo bisogno di abbinare la capacità di una singola cellula di dividersi dopo il trattamento, che la qualificherà come persistente, con un fenotipo misurabile che possa aiutarci a capire il funzionamento interno della cellula.

E potremmo dover fare questo per migliaia di cellule per catturare anche un solo persistente. Il nostro protocollo è stato sviluppato per essere facilmente implementabile rispetto ai metodi imprecisi di sandwich di agar o alla fabbricazione di dispositivi microfluidici, che possono essere tecnicamente impegnativi. Abbiamo scoperto che il nostro protocollo produce immagini riproducibili e stabili nel tempo con materiali minimi, il che significa che è sia conveniente che minimamente dispendioso per la raccolta di dati di qualità.

La nostra ricerca futura utilizzerà una combinazione di approcci omici e a singola cellula per studiare come i patogeni rispondono e si riprendono dal trattamento con diverse classi di antibiotici. Il nostro obiettivo finale è quello di sfruttare questa comprensione per sviluppare nuove strategie per migliorare il trattamento delle infezioni cliniche. Per iniziare, posizionare un vetrino coprioggetto sterile da 30 millimetri nella parte inferiore della base in acciaio inossidabile di un coprioggetto intercambiabile.

Infilare delicatamente l'inserto in policarbonato nella base, assicurandosi che il vetrino coprinte formi la base della camera e sigillarlo in posizione comprimendo l'O-ring in silicone attaccato. Posiziona un divisore personalizzato stampato in 3D contro il vetrino coprioggetti da 30 millimetri per evitare la contaminazione incrociata delle celle modali. Preparare l'agarosio all'1,5% in un tubo conico da 50 millilitri utilizzando il terreno di coltura desiderato e agitare delicatamente per mescolare.

Allentare il tappo del tubo conico e inserirlo in un bicchiere di vetro o in un supporto adatto al microonde. Microonde la miscela di agarosio alla massima potenza, fermandosi ogni tre o quattro secondi per far roteare e mescolare per evitare che trabocchi. Dopo un minuto, controlla se nella miscela rimane dell'agarosio non fuso.

Se uniformemente limpido, lasciare raffreddare brevemente l'agarosio a circa 60 gradi Celsius. Aggiungere gli antibiotici o i monconi pertinenti e agitare delicatamente per mescolare, evitando la formazione di bolle. Pipettare due millilitri di agarosio nella camera con il vetrino coprioggetti da 30 millimetri.

Stendere delicatamente un vetrino di copertura sterile da 25 millimetri sull'agarosio nell'apertura superiore della camera. Lasciare solidificare il tampone per una o due ore. Quando il tampone è solidificato, utilizzare un pennarello indelebile a punta fine per contrassegnare le posizioni e le identità di ciascun campione sul vetrino coprioggetto da 25 millimetri.

Capovolgere la camera in modo che l'anello di base in acciaio inossidabile sia rivolto verso l'alto e tenere con cura l'inserto in policarbonato sottostante mentre si svita la base. Mettere da parte la base in acciaio inox. Far scivolare il vetrino coprioggetto da 30 millimetri dal tampone di agarosio e gettarlo.

Diluire le colture cellulari di Pseudomonas aeruginosa o Staphylococcus aureus in PBS a una densità rada adatta alla visualizzazione di singole cellule. Pipettare energicamente su e giù per distribuire uniformemente le cellule. Individuare cinque microlitri di sospensioni cellulari diluite nei punti contrassegnati sul tampone di agarosio.

Una volta che le macchie si sono asciugate, posizionare un nuovo vetrino di copertura sterile da 30 millimetri sul tampone. Quindi tenere l'inserto in policarbonato con una mano e riavvitare lentamente la base in acciaio inossidabile sul vetrino coprioggetto. Una volta sigillata la camera, controllare se l'agarosio entra in contatto con la superficie del vetrino coprioggetto da 30 millimetri.

Usando l'estremità smussata delle pinzette, premere delicatamente contro il vetrino coprioggetti da 25 millimetri fino a quando l'agarosio tocca il vetrino coprioggetti da 30 millimetri in modo uniforme su tutta la sua superficie. Per iniziare, preparare i controlli ambientali del microscopio e della camera di imaging impostando le temperature dell'incubatore superiore del tavolino e dell'incubatore a camera grande a 37 gradi Celsius. Quindi, accendi l'umidificatore della camera.

Posizionare un preparato di tampone di agarosio nell'incubatore superiore del tavolino e chiudere la camera per consentire l'equilibrio. Prepara il software MetaMorph per l'acquisizione delle immagini configurando l'algoritmo di messa a fuoco automatica integrato per utilizzare il canale di fase durante l'acquisizione multidimensionale. Nella scheda Stage, impostare più posizioni del tavolino per ciascun campione, mirando ai campi visivi con densità cellulare distribuita uniformemente.

Quindi, nella scheda Time-Lapse, configurare la durata e la frequenza per l'acquisizione dell'immagine. Nella scheda Lunghezze d'onda, impostare i canali desiderati per l'acquisizione e regolare i tempi di esposizione in base all'intensità del segnale del campione. Una volta che il tampone di agarosio si è riscaldato nella camera, posizionare il coperchio umidificatore sull'incubatore da tavolo.

Successivamente, sul microscopio, passare dalla modalità di contrasto di fase alla modalità di contrasto interferenziale differenziale. Regolare il condensatore e il diaframma di apertura per ottenere una corretta illuminazione Kohler. Dopo aver completato le regolazioni, tornare alla modalità di contrasto di fase.

Passa a ciascuna posizione del tavolino, regola la messa a fuoco e reimposta la posizione del tavolino sul nuovo piano focale. Fare clic sul pulsante Acquisisci per avviare l'acquisizione multidimensionale. Dopo l'acquisizione, per compilare le immagini, aprire MetaMorph e utilizzare l'app Review Multidimensional Data per selezionare i canali o le lunghezze d'onda desiderati e includere tutti i punti temporali per ogni posizione dello stadio.

Fai clic su Carica immagini e salva ogni compilation con il rispettivo nome del canale come file TIFF. L'imaging time-lapse delle cellule di Staphylococcus aureus è stato condotto mostrando la colorazione con ioduro di propidio con il progredire del trattamento antibiotico, il che indicava un danno alla membrana. L'imaging di Pseudomonas aeruginosa durante il trattamento antibiotico ha mostrato cellule che subiscono la formazione di sferoplasti, filamentazione e condensazione citoplasmatica, accompagnate da colorazione con ioduro di propidio.

Il successo della preparazione del tampone di agarosio e le condizioni di imaging hanno permesso di osservare lo Staphylococcus aureus che si stava riprendendo dal trattamento antibiotico e lo Pseudomonas aeruginosa che si stava riprendendo dal trattamento antibiotico per formare grandi cluster derivati da singole cellule.