Name: Quantificazione della migrazione cellulare tridimensionale allinterno e allinterno di biomateriali granulari in idrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Impara a quantificare la migrazione cellulare tridimensionale in idrogel granulari usando microscopia confocale e software Imaris. Questo metodo permette di studiare l'infiltrazione cellulare e la rigenerazione tessutale.

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<ol><li>Jerka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+endothelial+cell+migration%3A+Insights+into+fundamental+forces%2C+inflammation%2C+biomaterial+applications%2C+and+tissue+regeneration+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Unraveling endothelial cell migration: Insights into fundamental forces, inflammation, biomaterial applications, and tissue regeneration strategies.</a> ACS Appl Bio Mater. 7 (4), 2054-2069 (2024).</li>
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<li>Qazi, T. H., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granular+hydrogels+for+endogenous+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Granular hydrogels for endogenous tissue repair.</a> Biomater Biosyst. 1, 100008(2021).</li>
<li>Tanner, G. I., Schiltz, L., Narra, N., Figueiredo, M. L., Qazi, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granular+hydrogels+improve+myogenic+invasion+and+repair+after+volumetric+muscle+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Granular hydrogels improve myogenic invasion and repair after volumetric muscle loss.</a> Adv Healthc Mater. 25, e2303576(2024).</li>
<li>Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+implants+modulate+healing+and+induce+shifts+in+local+macrophage+polarization+in+the+foreign+body+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction.</a> Ann Biomed Eng. 42 (7), 1508-1516 (2014).</li>
<li>Roosa, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugation+of+IL-33+to+microporous+annealed+particle+scaffolds+enhances+type+2-like+immune+responses+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Conjugation of IL-33 to microporous annealed particle scaffolds enhances type 2-like immune responses in vitro and in vivo.</a> Adv Healthc Mater. 13 (25), 2400249(2024).</li>
<li>Jaberi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+microgel+packing+to+tailor+the+physical+and+biological+properties+of+gelatin+methacryloyl+granular+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Engineering microgel packing to tailor the physical and biological properties of gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds.</a> Adv Healthc Mater. 13 (25), 2402489(2024).</li>
<li>Nandi, S., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+cell+migration+within+three-dimensional+in+vitro+wound+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments.</a> J Vis Exp. 126, e56099(2017).</li>
<li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Adv Mater. 34 (12), 2109194(2022).</li>
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<li>Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granular+hydrogels%3A+Emergent+properties+of+jammed+hydrogel+microparticles+and+their+applications+in+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Granular hydrogels: Emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration.</a> Curr Opin Biotechnol. 60, 1-8 (2019).</li>
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<li>Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+characterize+granular+hydrogel+rheological+properties%2C+porosity%2C+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion.</a> ACS Biomater Sci Eng. 8 (4), 1427-1442 (2022).</li>
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<li>Puiggalí-Jou, A., Asadikorayem, M., Maniura-Weber, K., Zenobi-Wong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor-loaded+sulfated+microislands+in+granular+hydrogels+promote+hMSCs+migration+and+chondrogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Growth factor-loaded sulfated microislands in granular hydrogels promote hMSCs migration and chondrogenic differentiation.</a> Acta Biomater. 166, 69-84 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 Falloidina</td><td>ThermoFisher</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>VWR International</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Colorante CMFDS verde, 1 mg</td><td>ThermoFisher</td><td>C2925</td><td>20 unità da 50 ug, 492/517 nm</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>ThermoFisher</td><td>75016085</td><td>serie ST Plus</td></tr><tr><td>Piastra trasparente a 96 pozzetti</td><td>MilliPore Sigma</td><td>CLS3997-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25950CQC</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Fibroblasti Basali Medium</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-030</td><td>480 mL, senza fenolo rosso</td></tr><tr><td>Kit per la crescita dei fibroblasti - Basso siero</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-041</td><td>7,5 mM L-glut, 5 ng/mL rh FGF basico, 5 ug/mL rh Insulina, 1 ug/mL Idrocortisone, 50 ug/mL Acido ascorbico, 2% FBS</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>Public accesso download</td></tr><tr><td>Fibroblasti dermici umani</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-012</td><td>Fibroblasti dermici umani adulti</td></tr><tr><td>ImageXpress Micro</td><td>Confocal Molecular Devices</td><td></td><td>Microscopio confocale a disco rotante con ingrandimenti 4x, 10x</td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Software di visualizzazione e analisi con immagini 3/4D,</td></tr><tr><td>incubatore</td> proprietario <td>ThermoFisher</td><td>Finnpipette F2 Pipette a volume variabile</td><td>HeraCell Vios 160i Incubatore a CO2, 165L</td></tr><tr><td>M-20 Micropiastra Secchio oscillante Rotore</td><td>ThermoFisher</td><td>75003624</td><td></td></tr><tr><td>Metilcellulosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>9004-67-5</td><td>Grado da laboratorio, in polvere,</td></tr><tr><td>provetta per microcentrifuga</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-129</td><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (4%)</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ19943K2</td><td>Per il fissaggio&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Corning</td><td>08-757-100A</td><td>Piastre di Petri batteriologiche con coperchio 35 x 10 mm</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>ThermoFisher</td><td>4642080</td><td>Finnpipette F2 Pipette a volume variabile</td></tr><tr><td>PBS</td><td>sterile Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Fisher Scientific</td><td>327371000</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione della migrazione cellulare tridimensionale all'interno e all'interno di biomateriali granulari in idrogel

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Questo protocollo mira a dettagliare i passaggi necessari per due nuovi saggi di migrazione granulare degli scaffold . Il metodo MAMA può essere utilizzato per valutare l'infiltrazione cellulare in un'interfaccia tissutale. Gli idrogel granulari sono un sistema più complesso rispetto agli idrogel sfusi e, pertanto, sono intrinsecamente più complessi da elaborare per la migrazione 9,20. È importante comprendere il processo graduale descritto nella Figura 1. Ogni passaggio si basa sul successivo ed è stato ottimizzato in questo protocollo. La semina di HDF a una densità di 120.000 cellule/cm2 si tradurrà in almeno l'80% di confluenza durante la notte (Figura 1A) e queste cellule non fluorescenti sono meglio etichettate con il colorante di tracciamento cellulare il giorno dell'esperimento per massimizzare il potenziale di imaging (Figura 1B). Questo protocollo corrisponde alla minore forza centrifuga utilizzata nel passaggio dell'HDF per mantenere la vitalità cellulare. A causa dell'angolo che si produce per una singola fase di centrifugazione, è necessario capovolgere la piastra di 180° per garantire che il gel si sposti per coprire completamente la superficie inferiore dei pozzetti (Figura 1C). Lasciare che le cellule si riprendano nell'incubatore per 30 minuti dopo la ricottura (Figura 1D) manterrà la vitalità cellulare e si tradurrà in una migrazione ottimale (Figura 1E). Un'ampia area di una piastra a 96 pozzetti può essere visualizzata con un obiettivo 4x e abbinata dal punto di tempo 0-24 ore (Figura 2A, B) per valutare ampiamente il comportamento cellulare. L'elaborazione delle immagini z-stack risultanti nel software di analisi fornisce analisi avanzate per più set di dati di grandi dimensioni in un'interfaccia facile da usare. Questo protocollo riassume i passaggi per creare set di dati per l'altezza della cella, o posizione Z, in ogni punto temporale visualizzato con le immagini rappresentative nella Figura 2B, C. L'analisi dei dati elaborati è illustrata nella Figura 3A, visualizzata utilizzando la media delle altezze mediane e la loro deviazione standard di ciascun punto temporale, mentre l'altezza di variazione della piega dalle celle non in migrazione a t = 0 h è mostrata nella Figura 3B. I dati sottostanti di questo metodo sono in genere distribuiti in modo non normale, quindi le mediane sono misure più robuste per il confronto e vengono quindi utilizzate per riassumere i dati.
Allo stesso modo, il metodo PLOSMA può essere utilizzato per valutare la motilità delle cellule consegnate all'interno di uno scaffold di idrogel granulare 3D. La Figura 4A delinea i passaggi del metodo PLOSMA ed è particolarmente importante seminare lo sferoide al centro del pozzetto. Si consiglia di centrare lo sferoide nel campo visivo, ma dipende dalle capacità del microscopio. La Figura 4B mostra immagini rappresentative della diffusione degli sferoidi per t = 0 h e t = 24 h scattate con un ingrandimento di 10x nel canale FITC (488 nm). Nel software, è possibile creare un piano di riferimento di origine e regolarlo per ogni z-stack (Figura 5A, B). Il software è in grado di tracciare la distanza radiale dal sistema di riferimento di origine ed esportarlo come set di dati desiderato (Figura 5C). La Figura 6A mostra un'immagine rappresentativa del rendering 3D dello sferoide t = 24 h, mentre la Figura 6B mostra la funzione Spot del software. Un esempio dei dati elaborati è mostrato nella Figura 7. La Figura 7A rappresenta la distanza media percorsa dal centro normalizzata alle distanze del Giorno 0. La Figura 7B isola le distanze percorse solo nel piano z, poiché questa è la direzione che il metodo PLOSMA mira a studiare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig01.jpg"> 
Figura 1: Saggio di migrazione ascendente basato su monostrato Coltura cellulare e imaging. Schema delle fasi principali dell'elaborazione di cellule e gel per MAMA. (A) Le cellule vengono coltivate fino alla confluenza durante la notte e (B) il colorante di tracciamento cellulare viene aggiunto appena prima dell'aggiunta del gel granulare. Lo scaffold viene assemblato tramite centrifugazione a piastre (C) e stabilizzato con fotoreticolazione (D). L'imaging in più punti temporali consente (E) la visualizzazione della migrazione cellulare verso l'alto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig02.jpg"> 
Figura 2: Elaborazione delle immagini MAMA. Immagini rappresentative dell'elaborazione delle immagini. Confronto tra vista dall'alto e laterale di immagini confocali grezze a (A) t = 0 e (B) t = 24 ore nel canale FITC con ingrandimento 4x. (B) Confronto della vista dall'alto e laterale delle altezze Z della posizione della cella elaborata a (C) t = 0 e (D) t = 24 h. L'elaborazione per 24 ore include la sottrazione delle altezze z mediane non migranti. Barre di scala = 500 μm. Abbreviazioni: MAMA = Monolayer-based Ascending Migration Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig03v2.jpg"> 
Figura 3: Analisi dell'output della migrazione cellulare MAMA. (A) Posizione mediana Z e deviazione standard delle altezze cellulari in ciascuna replica (n = 6) ai punti temporali t = 0 (27,0 μm ± 1,4 μm) e t = 24 h (46,6 μm ± 10,8 μm). (B) Migrazione delle cellule a 24 h normalizzata a 0 h e riportata come fold change (1,8 ± 0,4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig03largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig04.jpg"> 
Figura 4: Coltura cellulare e imaging del saggio di migrazione degli sferoidi verso l'esterno a strato parallelo (PLOSMA). (A) Schema che descrive le fasi della stratificazione dello scaffold (B) Proiezioni di intensità massima dello sferoide prese a 0 e 24 h. Le immagini sono state scattate tramite microscopia fluorescente confocale nel canale FITC (488 nm) con ingrandimento 10x. Barre di scala = 200 μm. Abbreviazioni: PLOSMA = Parallel Layer Outward Spheroid Migration Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig05.jpg"> 
Figura 5: Creazione di un nuovo piano di riferimento di origine. (A) Il pulsante del nuovo piano di riferimento di origine è delineato da un riquadro rosso. (B) La nuova origine è impostata per essere al centro dello sferoide in tutte e tre le dimensioni. (C) Le metriche di output mostrate sono le distanze delle superfici delle celle dal sistema di riferimento di origine, che descrive la distanza di migrazione delle celle dal centro. Barra della scala = 120 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig06.jpg"> 
Figura 6: Rendering 3D dello sferoide incorporato a 24 h. (A) Sferoide elaborato nello spazio 3D. (B) Il centro dello stesso sferoide è stato determinato utilizzando la funzione del sistema di riferimento dell'origine in IMARIS, e la diffusione delle celle è codificata a colori in base alla distanza dall'origine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig07.jpg"> 
Figura 7: Esempi di output per PLOSMA. (A) Esempi di risultati PLOSMA che mostrano la distanza percorsa in μm. La distanza media percorsa è stata di 240,8 μm ± 36,87 μm. (B) Variazione di piega dell'altezza Z (tf/t0) della germinazione degli sferoidi. La variazione media delle pieghe è stata di 3,82 ± 1,495. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Quantificazione della migrazione cellulare tridimensionale all'interno e all'interno di biomateriali granulari in idrogel

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...

quantifying-three-dimensional-cell-migration-within-into-granular

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Migrazione delle cellule è un fenomeno biologico che è coinvolto in una pletora di fisiologica, come la guarigione delle ferite e le risposte immunitarie, e dei processi fisiopatologici, come il cancro. Il test di migrazione matrice 3D-collagene è uno strumento versatile per analizzare le proprietà migratorie dei diversi tipi di cellule all'interno di in un ambiente fisiologico simile a 3D.

Analisi della migrazione delle cellule all&#39;interno di una tridimensionale di collagene Matrix

Le proprietà meccaniche e microstruttura della matrice extracellulare influenzano fortemente la migrazione delle cellule 3D. Un metodo in vitro per studiare il comportamento di migrazione delle cellule spazio-temporale in ambienti biofisico variabili, sia a livello della popolazione e delle singole celle, è descritto.

Concentric Sistema Gel per studiare il ruolo biofisica di Matrix Microenvironment sulla migrazione Cell 3D

La migrazione cellulare è una parte importante dello sviluppo e della vita umana. Al fine di comprendere i meccanismi che possono alterare la migrazione cellulare, presentiamo un sistema di diffusione a gradiente planare per studiare la chemiotassi in una matrice di collagene 3D, che consente di superare i limiti della moderna camera di diffusione dei saggi esistenti.

Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix

L'obiettivo del presente protocollo è quello di valutare l'effetto dei fattori pro - e anti - migratory su migrazione delle cellule all'interno di una matrice tridimensionale di fibrina.

Che caratterizzano la migrazione delle cellule all'interno del tridimensionale In Vitro ferita ambienti

Qui presentiamo un sistema di coltura motrice mista ex-vivo per lo studio della migrazione delle cellule glioma umane (hGC) in tempo reale. Questo modello fornisce la capacità di osservare le interazioni tra hGC e assoni mielinati e non mielinati all'interno di una camera compartimentata.

Monitoraggio in tempo reale della migrazione delle cellule del Glioma umano sulle coculture di Asse-Olgon-Oligodendroce

Le forze meccaniche sono importanti per controllare la migrazione cellulare. Questo protocollo dimostra l'uso di idrogel elastici che possono essere deformati utilizzando una micropipetta di vetro e un micromanipolatore per stimolare le cellule con un gradiente di rigidità locale per suscitare cambiamenti nella struttura cellulare e nella migrazione.

Analisi A singola cella Durotaxis per valutare il controllo meccanico del movimento cellulare e gli eventi di segnalazione correlati

La migrazione collettiva delle cellule nello sviluppo, nella guarigione delle ferite e nella metastasi del cancro è spesso guidata dai gradienti dei fattori di crescita o delle molecole di segnalazione. Descritto qui è un sistema sperimentale che combina la microscopia a trazione con un sistema microfluidico e una dimostrazione di come quantificare la meccanica della migrazione collettiva in gradiente biochimico.

Microscopia di trazione integrata con microfluidica per la migrazione collettiva chemiotattica

Impara a quantificare la migrazione cellulare tridimensionale in idrogel granulari usando microscopia confocale e software Imaris. Questo metodo permette di studiare l'infiltrazione cellulare e la rigenerazione tessutale.

Quantificazione della migrazione cellulare tridimensionale all'interno e all'interno di biomateriali granulari in idrogel

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