Name: Imaging dal vivo del riciclaggio delle vescicole sinaptiche nella giunzione neuromuscolare di zebrafish larvale sezionato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Scopri l'imaging dal vivo del riciclaggio delle vescicole sinaptiche nella giunzione neuromuscolare di zebrafish larvale sezionato. Questo metodo pHluorin-based offre una piattaforma economica per studiare la trasmissione sinaptica con microscopia a epifluorescenza convenzionale.

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<ol><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle.</a> Ann Rev Neurosci. 27, 509-547 (2004).</li>
<li>Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+presynaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing presynaptic function.</a> Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+phluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The use of phluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle+revisited%3A+New+insights+into+the+modes+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms.</a> J Neurosci. 39 (42), 8209-8216 (2019).</li>
<li>Egashira, Y., Takase, M., Takamori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vacuolar-type+h%2B+atpase-mediated+proton+influx+into+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vacuolar-type h+ atpase-mediated proton influx into synaptic vesicles.</a> J Neurosci. 35 (8), 3701-3710 (2015).</li>
<li>Egashira, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+ph+dynamics+in+gabaergic+synaptic+vesicles+illuminates+the+mechanism+and+kinetics+of+gaba+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unique ph dynamics in gabaergic synaptic vesicles illuminates the mechanism and kinetics of gaba loading.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10702-10707 (2016).</li>
<li>Schoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snare+function+analyzed+in+synaptobrevin%2Fvamp+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Snare function analyzed in synaptobrevin/vamp knockout mice.</a> Science. 294 (5544), 1117-1122 (2001).</li>
<li>Takamori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+anatomy+of+a+trafficking+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular anatomy of a trafficking organelle.</a> Cell. 127 (4), 831-846 (2006).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).</li>
<li>Fernandez-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles+interchange+their+membrane+proteins+with+a+large+surface+reservoir+during+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling.</a> Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).</li>
<li>Kwon, S. E., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptophysin+regulates+the+kinetics+of+synaptic+vesicle+endocytosis+in+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons.</a> Neuron. 70 (5), 847-854 (2011).</li>
<li>Voglmaier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+endocytic+pathways+control+the+rate+and+extent+of+synaptic+vesicle+protein+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct endocytic pathways control the rate and extent of synaptic vesicle protein recycling.</a> Neuron. 51 (1), 71-84 (2006).</li>
<li>Balaji, J., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-vesicle+imaging+reveals+that+synaptic+vesicle+exocytosis+and+endocytosis+are+coupled+by+a+single+stochastic+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-vesicle imaging reveals that synaptic vesicle exocytosis and endocytosis are coupled by a single stochastic mode.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (51), 20576-20581 (2007).</li>
<li>Santos, M. S., Park, C. K., Foss, S. M., Li, H., Voglmaier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+the+vesicular+gaba+transporter+to+functional+vesicle+pools+by+an+atypical+dileucine-like+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sorting of the vesicular gaba transporter to functional vesicle pools by an atypical dileucine-like motif.</a> J Neurosci. 33 (26), 10634-10646 (2013).</li>
<li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+and+asynchronous+modes+of+synaptic+transmission+utilize+different+calcium+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synchronous and asynchronous modes of synaptic transmission utilize different calcium sources.</a> Elife. 2, e01206(2013).</li>
<li>Wen, H., Hubbard, J. M., Wang, W. C., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatigue+in+rapsyn-deficient+zebrafish+reflects+defective+transmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fatigue in rapsyn-deficient zebrafish reflects defective transmitter release.</a> J Neurosci. 36 (42), 10870-10882 (2016).</li>
<li>Wyatt, R. M., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+synaptic+vesicle+release+at+neuromuscular+synapses+of+mice+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in synaptic vesicle release at neuromuscular synapses of mice expressing synaptophluorin.</a> J Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).</li>
<li>Tabares, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+synaptic+function+at+the+neuromuscular+junction+of+a+mouse+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring synaptic function at the neuromuscular junction of a mouse expressing synaptophluorin.</a> J Neurosci. 27 (20), 5422-5430 (2007).</li>
<li>Odermatt, B., Nikolaev, A., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+of+luminance+and+contrast+by+linear+and+nonlinear+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Encoding of luminance and contrast by linear and nonlinear synapses in the retina.</a> Neuron. 73 (4), 758-773 (2012).</li>
<li>Almeida, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+induces+axonal+hotspots+of+synaptic+vesicle+fusion+that+promote+sheath+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Myelination induces axonal hotspots of synaptic vesicle fusion that promote sheath growth.</a> Curr Biol. 31 (17), 3743-3754.e5 (2021).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+silent+sensory+hair+cells+in+zebrafish+are+recruited+after+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage.</a> Nat Comm. 9 (1), 1388(2018).</li>
<li>Vaithianathan, T., Henry, D., Akmentin, W., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+dynamics+of+synaptic+vesicle+trafficking+and+fusion+at+the+presynaptic+active+zone%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nanoscale dynamics of synaptic vesicle trafficking and fusion at the presynaptic active zone.</a> eLife. 5, e13245(2016).</li>
<li>Vaithianathan, T., Wollmuth, L. P., Henry, D., Zenisek, D., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+newly+released+synaptic+vesicle+proteins+at+ribbon+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Tracking newly released synaptic vesicle proteins at ribbon active zones.</a> iScience. 17, 10-23 (2019).</li>
<li>Shrestha, A. P., Vaithianathan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+dynamics+of+single+fused+synaptic+vesicle+proteins+from+a+single+ribbon+active+zone+in+zebrafish+retinal+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tracking the dynamics of single fused synaptic vesicle proteins from a single ribbon active zone in zebrafish retinal bipolar cells.</a> STAR Protoc. 3 (1), 101107(2022).</li>
<li>Egashira, Y., Zempo, B., Sakata, S., Ono, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+neuromuscular+junction+research+prompted+by+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opinion+Physiol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in neuromuscular junction research prompted by the zebrafish model.</a> Curr Opinion Physiol. 4, 70-75 (2018).</li>
<li>Egashira, Y., Kumade, A., Ojida, A., Ono, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneously+recycling+synaptic+vesicles+constitute+readily+releasable+vesicles+in+intact+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneously recycling synaptic vesicles constitute readily releasable vesicles in intact neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 42 (17), 3523-3536 (2022).</li>
<li>Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+synaptic+plasticity+in+acute+hippocampal+slices+maintained+in+a+small-volume+recycling-%2C+perfusion-%2C+and+submersion-type+chamber+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system.</a> J Vis Exp. (131), e55936(2018).</li>
<li>Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+axonal+outgrowth+of+identified+motoneurons+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish.</a> J Neurosci. 6 (8), 2278-2289 (1986).</li>
<li>Westerfield, M., Mcmurray, J. V., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+motoneurons+and+their+innervation+of+axial+muscles+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish.</a> J Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).</li>
<li>Brehm, P., Wen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+neuromuscular+junction%3A+The+power+of+n%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Zebrafish neuromuscular junction: The power of n.</a> Neurosci Lett. 713, 134503(2019).</li>
<li>Ben Fredj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+and+activity-dependent+competition+regulates+axon+arbor+maturation%2C+growth+arrest%2C+and+territory+in+the+retinotectal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection.</a> J Neurosci. 30 (32), 10939-10951 (2010).</li>
<li>Mandal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+mitochondrial+transport+is+essential+for+organelle+distribution+and+health+in+zebrafish+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde mitochondrial transport is essential for organelle distribution and health in zebrafish neurons.</a> J Neurosci. 41 (7), 1371-1392 (2021).</li>
<li>Wong, H. C., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescent+indicators+for+in+vivo+quantification+of+spontaneous+or+evoked+motor+neuron+presynaptic+activity+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish.</a> STAR Protoc. 3 (4), 101766(2022).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+vesicle+recycling+in+the+synaptic+bouton%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous vesicle recycling in the synaptic bouton.</a> Front Cell Neurosci. 8, 409(2014).</li>
<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensors+and+regulators+of+intracellular+ph%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensors and regulators of intracellular ph.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 50-61 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Obiettivo ad immersione in acqua 40x</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di perfusione a flusso di gravità a 4 canali</td><td>ALA</td><td>VCPlus-4G</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo 5x</td><td>Olympus</td><td>NPLN5X</td><td></td></tr><tr><td>Camera di imaging su misura</td><td>Physiotech</td><td>su misura</td><td>Una lastra acrilica nera (10,7 cm di diametro, 3 mm di spessore) con un pozzetto (1 cm di diametro nella parte inferiore, 1,5 cm di diametro nella parte superiore) che tiene circa 0,5 ml di perfusato.</td></tr><tr><td>Dispositivo I/O digitale</td><td>Arduino</td><td>Uno Rev3</td><td></td></tr><tr><td>D-Tubocurarina dicloruro pentaidrato</td><td>Sigma</td><td>93750</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Office Professional Plus 2016</td><td></td></tr><tr><td>Fiji / imageJ</td><td>https://imagej.net/</td> <td>imageJ 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>Fine forcipe</td><td>AsOne</td><td>7-562-05 (Dumont #5)</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipetta</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td>La punta deve essere tagliata e lucidata a fuoco fino a quando il diametro finale è di 1,5&ndash; 2 mm.&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastra di Petri in vetro</td><td>AsOne</td><td>1-4564-06</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Ver. 6.37</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore di soluzioni in linea</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di illuminazione a LED</td><td>X-cyte</td><td>XYLIS</td><td></td></tr><tr><td>Blu di metilene</td><td>Wako</td><td>133-06962</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td>https://micro-manager.org/</td> <td>Ver. 2.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Mini morsetto magnetico per provetta di perfusione</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1553</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore motorizzato</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>Piastra portacampioni mobile motorizzata</td><td>Scientifica</td><td>MMSP</td><td></td></tr><tr><td>Porta pipette</td><td>Narishige</td><td>H-13</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per pipette</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Filo di platino (&phi; 0,1 mm)</td><td>Nilaco</td><td>PT-351165</td><td></td></tr><tr><td>Filo di platino (&phi; 0,5 mm)</td><td>Niaco</td><td>PT-351381</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>AsOne</td><td>8-3086-02 (Feather #11)</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera scientifica cMOS</td><td>Thorlabs</td><td>CC215MU</td><td></td></tr><tr><td>Sale marino</td><td>NAPQO</td><td>Instant Ocean</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Isolatore di stimolo</td><td>AMPI</td><td>ISO-FLEX</td><td></td></tr><tr><td>Tubo di aspirazione</td><td>Warner Instruments</td><td>ST-3, 64-1406</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>Capillare in vetro Theta</td><td>Sutter Instrument</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina (MS-222)</td><td>TCI</td><td>T0941</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio verticale</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging dal vivo del riciclaggio delle vescicole sinaptiche nella giunzione neuromuscolare di zebrafish larvale sezionato

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

Se il campione sezionato viene preparato senza gravi danni tissutali e l'elettrodo di stimolazione viene inserito correttamente nel midollo spinale, è possibile ottenere una robusta risposta della pHluorin mediante stimolazione elettrica ad alta frequenza (Figura 4D, E). La fluorescenza basale pre-stimolo era probabilmente dovuta alla sonda presente sulla superficie della presinapsi. L'aumento della fluorescenza durante la stimolazione riflette il rilascio esocitotico della ...

Imaging dal vivo del riciclaggio delle vescicole sinaptiche nella giunzione neuromuscolare di zebrafish larvale sezionato

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...

Studiamo il meccanismo molecolare e cellulare della trasmissione sinaptica utilizzando la giunzione neuromascolare di zebrafish larvale come sistema modello. Siamo interessati a chiarire la moderazione regolatoria della sinapsi in risposta a varie condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo ci permette di visualizzare la nuova trasmissione indotta dal potenziale d'azione nella giunzione neuromuscolare larvale del pesce zebra con una migliore sensibilità.Possiamo monitorare la funzione sinaptica suscitata da una stimolazione moderata, che non è stata testata in precedenza. Questo protocollo di imaging può essere eseguito con un microscopio a epifluorescenza convenzionale e non richiede necessariamente un microscopio a scansione laser confocale. In altre parole, questo metodo fornisce una piattaforma economica per l'imaging della funzione neuromuscolare rispetto ad altre configurazioni sperimentali.Per preparare 200 millilitri di soluzione extracellulare, mescolare 6,4 millilitri di cloruro di sodio 3,5 molari, 0,4 millilitri di cloruro di potassio molare, 1 millilitro di HEPES molare, 0,4 millilitri di cloruro di calcio molare, 0,2 millilitri di cloruro di magnesio molare e 360 milligrammi di glucosio. Quindi aggiungere acqua ultrapura per portare il volume totale a 200 millilitri. Aggiungere 20 microlitri di soluzione madre di D-tubocurarina da 15 millimolari per preparare 100 millilitri di soluzione extracellulare con 3 micromolari di D-tubocurarina.Per preparare 25 millilitri di soluzione extracellulare contenente lo 0,02% di tricaina, aggiungere 0,5 millilitri di soluzione madre di tricaina all'1% a 25 millilitri di soluzione. Utilizzando un estrattore per micropipette, tirare i capillari in vetro theta fino a quando il diametro della punta non è compreso tra 3 e 10 micrometri. Riempire la pipetta con la soluzione extracellulare.Inserire un sottile filo di platino in ciascuna apertura del capillare e tenere l'elettrodo della pipetta in vetro theta sul supporto della pipetta del micromanipolatore motorizzato. Quindi collegare l'estremità posteriore di ciascun filo all'isolatore dello stimolo. Per 25 millilitri di soluzione extracellulare contenente lo 0,02% di tricaina in una piastra di Petri di vetro, trasferire una larva di pesce zebra nella piastra di Petri per la dissezione.Usa due pinze sottili per sbucciare la pelle delle larve. Usa la prima pinza per tenere le larve in posizione e pizzica la pelle sul lato dorsale della vescica natatoria con le altre pinze. Quindi, usando il bisturi, rimuovere la vescica natatoria, gli organi interni e la testa.Utilizzare una pipetta pasteur in vetro con punta lucidata a fuoco per trasferire il campione di pesce zebra sezionato nella camera di imaging. Fissare meccanicamente il campione con un filo di nylon incollato a un filo di platino a forma di C per orientarlo con un angolo approssimativamente parallelo all'elettrodo stimolante. Perfondere il campione utilizzando un sistema a flusso gravitazionale a una velocità di 1 millilitro al minuto con una soluzione extracellulare contenente 3 micromolari di D-tubocurarina.Quindi, inserire l'elettrodo di stimolazione nel midollo spinale. Posizionare con attenzione la punta dell'elettrodo vicino ai motoneuroni spinali, identificati come neuroni TagRFP-positivi situati sul lato ventrale del midollo spinale. Far avanzare l'elettrodo con un angolo obliquo dal segmento adiacente alla posizione target.Per iniziare su un computer, selezionare la regione di imaging in base all'immagine dal vivo della fluorescenza TagRFP. Assicurarsi che l'area selezionata includa più bottoni automatici ed escluda quelli vicini al contorno del segmento del corpo. Commutare l'unità del filtro a fluorescenza GFP fluorescenza al fluoro per l'imaging.Quindi, regolare l'intensità della sorgente luminosa per ottenere un'immagine luminosa in modalità time lapse a 1 hertz senza saturazione. Immettere il tempo di esposizione a 100 nel campo millisecondi di esposizione della finestra di micromanager. Configurare il software di acquisizione delle immagini e il dispositivo di input output digitale per sincronizzare l'acquisizione delle immagini con la stimolazione elettrica.Successivamente, determina la frequenza di stimolazione, il numero di potenziali d'azione e il ritardo tra l'inizio dell'acquisizione dell'immagine e l'erogazione della stimolazione nello script Arduino. In base a queste impostazioni, calcolare il numero totale di immagini necessarie per l'acquisizione e inserire questo valore nel campo di conteggio della finestra di acquisizione multidimensionale in micromanager. Impostare un intervallo di 1 secondo nel campo dell'intervallo per l'imaging time lapse a 1 hertz.Per la stimolazione elettrica, configurare l'isolatore di stimolo in modo che fornisca impulsi di tensione costante di 1 millisecondo di 70 millivolt. Eseguire il comando digitalizzatore per avviare l'acquisizione dell'immagine. Monitorare il processo per verificare che non vi sia una deriva dell'immagine inaccettabile e che il fluoro e le risposte siano osservabili.Modificare l'intensità della stimolazione, come la frequenza in numero di impulsi, o regolare la temperatura in base allo scopo sperimentale. Salvare le immagini time-lapse come stack di serie temporali TIFF. Le sinapsi con grandi aumenti del segnale sono state selezionate per l'analisi, sebbene tutti i bottoni abbiano mostrato cambiamenti rilevabili nella condizione di potenziale d'azione di 20 hertz 100, Robuste risposte al fluoro sono state osservate dopo stimolazione elettrica ad alta frequenza con cambiamenti di fluorescenza che indicano esocitosi durante la stimolazione e successivo decadimento, riflettendo l'endocitosi e la riacidificazione delle vescicole sinaptiche.Le costanti di tempo di decadimento della fluorescenza variavano con lo stimolo, l'intensità e la temperatura con 20 hertz 25 potenziali d'azione che mostravano a 16,6 secondi, 20 hertz 100 potenziali d'azione a 56,8 secondi e 50 hertz 500 potenziali d'azione a 62,7 secondi.

live-imaging-synaptic-vesicle-recycling-neuromuscular-junction

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Neuroscienze

Questo protocollo descrive l'imaging di singoli neuroni o cellule della cresta neurale nel vivere embrioni di zebrafish. Questo metodo è utilizzato per esaminare i comportamenti e la localizzazione cellulare di actina mediante fluorescenza confocale microscopia time-lapse.

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

Questo protocollo descrive la dissezione dal vivo...

Nella visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche In Drosophila assoni larvali segmentale

Larvale zebrafish rappresentano il primo sistema modello vertebrato per consentire la registrazione simultanea patch clamp da un neurone spinale a motore e la destinazione del muscolo scheletrico. Questo video mostra i metodi microscopici utilizzato per identificare un CAP segmentale motore neuroni e cellule muscolari bersaglio così come le metodologie per la registrazione da ogni tipo di cellula.

Accoppiato a pinza registrazioni patch da Motor-neurone e muscolo scheletrico bersaglio in Zebrafish

Dissezione e immagini di zone attive nel Drosophila Giunzione neuromuscolare

Un semplice dispositivo microfluidico è stato sviluppato per eseguire anestetico...

Semplici dispositivi microfluidici per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Questo video dimostra un protocollo per studiare il riciclaggio delle vescicole sinaptiche alle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila che esprimono canalrodopsina utilizzando un colorante fluorescente. La luce blu attiva le canalrodopsine, causando l'afflusso di calcio e l'esocitosi delle vescicole sinaptiche. Il colorante si integra nelle membrane neuronali e viene internalizzato durante l'endocitosi, con conseguente miglioramento della fluorescenza. Un'ulteriore stimolazione...

Analisi del riciclaggio delle vescicole sinaptiche e dell'assorbimento del colorante fluorescente nelle larve di Drosophila

Fonte: Schramm, P. et al. Imaging in vivo di tessuto cerebrale completamente attivo in larve di zebrafish sveglie e giovani mediante rimozione del cranio e della pelle. J. Vis. Exp. (2021)Questo video dimostra l'imaging in vivo dei neuroni cerebellari nelle larve transgeniche di zebrafish, che esprimono proteine fluorescenti nei neuroni di Purkinje. Il processo prevede l'anestetizzazione delle larve, l'immobilizzazione in agarosio e la rimozione accurata della pelle pigmentata per migliorare la...

Imaging in vivo del cervello larvale di pesce zebra per la visualizzazione dei neuroni cerebellari

Fonte: Lukasz, D., et al. Imaging in vivo del calcio delle cellule ciliate della linea laterale in larve di pesce zebra. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra l'imaging dal vivo dell'afflusso di calcio nelle cellule ciliate della linea laterale di una larva di pesce zebra transgenico paralizzata utilizzando un microscopio confocale. La stimolazione meccanica dei fasci di capelli tramite impulsi di fluido induce l'ingresso di calcio attraverso i canali di meccanotrasduzione e i canali...

Imaging della dinamica del calcio nelle cellule ciliate in linea laterale di larve di pesce zebra

Zebrafish è un sistema di modello che ha molte caratteristiche importanti, compreso chiarezza ottica, rapido sviluppo esterno e, di particolare importanza nel campo dell'udito e l'equilibrio, situato esternamente cellule ciliate sensoriali. Questo articolo descrive come transgenici zebrafish può essere utilizzato per analisi sia delle cellule cigliate mechanosensation e funzione presinaptica in toto.

Nel calcio in Vivo Imaging delle cellule ciliate linea laterale in Zebrafish larvale

Dimostriamo un metodo che sfrutta la microscopia confocale a scansione rapida per eseguire l'imaging dal vivo delle cellule della microglia nel tectum ottico del pesce zebra in via di sviluppo, consentendo l'analisi della dinamica di queste cellule in vivo.

Imaging dal vivo e caratterizzazione della dinamica della microglia nell'embrione di zebrafish

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per esaminare l'attività neurale nelle regioni cerebrali del pesce zebra transgenico che esprimono indicatori di calcio GCaMP utilizzando la microscopia confocale.

In vivo Imaging a fluorescenza confocale dell'attività neurale indotta dalla stimolazione sensoriale in larve di pesce zebra parzialmente trattenute

Scopri l'imaging dal vivo del riciclaggio delle vescicole sinaptiche nella giunzione neuromuscolare di zebrafish larvale sezionato. Questo metodo pHluorin-based offre una piattaforma economica per studiare la trasmissione sinaptica con microscopia a epifluorescenza convenzionale.

Imaging dal vivo del riciclaggio delle vescicole sinaptiche nella giunzione neuromuscolare di zebrafish larvale sezionato

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