Imaging dal vivo del riciclaggio delle vescicole sinaptiche nella giunzione neuromuscolare di zebrafish larvale sezionato

Studiamo il meccanismo molecolare e cellulare della trasmissione sinaptica utilizzando la giunzione neuromascolare di zebrafish larvale come sistema modello. Siamo interessati a chiarire la moderazione regolatoria della sinapsi in risposta a varie condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo ci permette di visualizzare la nuova trasmissione indotta dal potenziale d'azione nella giunzione neuromuscolare larvale del pesce zebra con una migliore sensibilità.

Possiamo monitorare la funzione sinaptica suscitata da una stimolazione moderata, che non è stata testata in precedenza. Questo protocollo di imaging può essere eseguito con un microscopio a epifluorescenza convenzionale e non richiede necessariamente un microscopio a scansione laser confocale. In altre parole, questo metodo fornisce una piattaforma economica per l'imaging della funzione neuromuscolare rispetto ad altre configurazioni sperimentali.

Per preparare 200 millilitri di soluzione extracellulare, mescolare 6,4 millilitri di cloruro di sodio 3,5 molari, 0,4 millilitri di cloruro di potassio molare, 1 millilitro di HEPES molare, 0,4 millilitri di cloruro di calcio molare, 0,2 millilitri di cloruro di magnesio molare e 360 milligrammi di glucosio. Quindi aggiungere acqua ultrapura per portare il volume totale a 200 millilitri. Aggiungere 20 microlitri di soluzione madre di D-tubocurarina da 15 millimolari per preparare 100 millilitri di soluzione extracellulare con 3 micromolari di D-tubocurarina.

Per preparare 25 millilitri di soluzione extracellulare contenente lo 0,02% di tricaina, aggiungere 0,5 millilitri di soluzione madre di tricaina all'1% a 25 millilitri di soluzione. Utilizzando un estrattore per micropipette, tirare i capillari in vetro theta fino a quando il diametro della punta non è compreso tra 3 e 10 micrometri. Riempire la pipetta con la soluzione extracellulare.

Inserire un sottile filo di platino in ciascuna apertura del capillare e tenere l'elettrodo della pipetta in vetro theta sul supporto della pipetta del micromanipolatore motorizzato. Quindi collegare l'estremità posteriore di ciascun filo all'isolatore dello stimolo. Per 25 millilitri di soluzione extracellulare contenente lo 0,02% di tricaina in una piastra di Petri di vetro, trasferire una larva di pesce zebra nella piastra di Petri per la dissezione.

Usa due pinze sottili per sbucciare la pelle delle larve. Usa la prima pinza per tenere le larve in posizione e pizzica la pelle sul lato dorsale della vescica natatoria con le altre pinze. Quindi, usando il bisturi, rimuovere la vescica natatoria, gli organi interni e la testa.

Utilizzare una pipetta pasteur in vetro con punta lucidata a fuoco per trasferire il campione di pesce zebra sezionato nella camera di imaging. Fissare meccanicamente il campione con un filo di nylon incollato a un filo di platino a forma di C per orientarlo con un angolo approssimativamente parallelo all'elettrodo stimolante. Perfondere il campione utilizzando un sistema a flusso gravitazionale a una velocità di 1 millilitro al minuto con una soluzione extracellulare contenente 3 micromolari di D-tubocurarina.

Quindi, inserire l'elettrodo di stimolazione nel midollo spinale. Posizionare con attenzione la punta dell'elettrodo vicino ai motoneuroni spinali, identificati come neuroni TagRFP-positivi situati sul lato ventrale del midollo spinale. Far avanzare l'elettrodo con un angolo obliquo dal segmento adiacente alla posizione target.

Per iniziare su un computer, selezionare la regione di imaging in base all'immagine dal vivo della fluorescenza TagRFP. Assicurarsi che l'area selezionata includa più bottoni automatici ed escluda quelli vicini al contorno del segmento del corpo. Commutare l'unità del filtro a fluorescenza GFP fluorescenza al fluoro per l'imaging.

Quindi, regolare l'intensità della sorgente luminosa per ottenere un'immagine luminosa in modalità time lapse a 1 hertz senza saturazione. Immettere il tempo di esposizione a 100 nel campo millisecondi di esposizione della finestra di micromanager. Configurare il software di acquisizione delle immagini e il dispositivo di input output digitale per sincronizzare l'acquisizione delle immagini con la stimolazione elettrica.

Successivamente, determina la frequenza di stimolazione, il numero di potenziali d'azione e il ritardo tra l'inizio dell'acquisizione dell'immagine e l'erogazione della stimolazione nello script Arduino. In base a queste impostazioni, calcolare il numero totale di immagini necessarie per l'acquisizione e inserire questo valore nel campo di conteggio della finestra di acquisizione multidimensionale in micromanager. Impostare un intervallo di 1 secondo nel campo dell'intervallo per l'imaging time lapse a 1 hertz.

Per la stimolazione elettrica, configurare l'isolatore di stimolo in modo che fornisca impulsi di tensione costante di 1 millisecondo di 70 millivolt. Eseguire il comando digitalizzatore per avviare l'acquisizione dell'immagine. Monitorare il processo per verificare che non vi sia una deriva dell'immagine inaccettabile e che il fluoro e le risposte siano osservabili.

Modificare l'intensità della stimolazione, come la frequenza in numero di impulsi, o regolare la temperatura in base allo scopo sperimentale. Salvare le immagini time-lapse come stack di serie temporali TIFF. Le sinapsi con grandi aumenti del segnale sono state selezionate per l'analisi, sebbene tutti i bottoni abbiano mostrato cambiamenti rilevabili nella condizione di potenziale d'azione di 20 hertz 100, Robuste risposte al fluoro sono state osservate dopo stimolazione elettrica ad alta frequenza con cambiamenti di fluorescenza che indicano esocitosi durante la stimolazione e successivo decadimento, riflettendo l'endocitosi e la riacidificazione delle vescicole sinaptiche.

Le costanti di tempo di decadimento della fluorescenza variavano con lo stimolo, l'intensità e la temperatura con 20 hertz 25 potenziali d'azione che mostravano a 16,6 secondi, 20 hertz 100 potenziali d'azione a 56,8 secondi e 50 hertz 500 potenziali d'azione a 62,7 secondi.