Valutazione della fagocitosi microgliale dei detriti mielinici in vitro sotto stimolazione magnetica ripetuta

[Istruttore] L'ambito del nostro studio si concentra sulla ricerca in neuro-riabilitazione e terapia con simulazione magnetica. Questo protocollo può fornire nuove idee per la stimolazione magnetica nell'esplorare come influisce su una funzione chiara. In futuro ci concentreremo sulla neuroriabilitazione e sulla terapia di stimolazione magnetica.

[Istruttore] Per iniziare, ottieni una testa decapitata di un topo femmina. Sezionare la testa sul ghiaccio. Con un paio di forbici, taglia in due il cranio per esporre completamente il cervello e facilitarne la completa rimozione. Usa forbici e pinze per asportare meticolosamente e asetticamente le membrane, il cervelletto e l'ippocampo. Pulisci il cervello tre volte con PBS per rimuovere eventuali residui di sangue o tessuto. Trasferire il cervello pulito in 10 millilitri di soluzione di saccarosio sterile 0,32 molari. Con un paio di forbici microchirurgiche, tagliare il tessuto cerebrale a pezzi per ottenere una miscela di tessuto cerebrale e saccarosio. Quindi, trasferire la miscela di tessuto cerebrale e saccarosio in un omogeneizzatore sterile da 50 millilitri. Aggiungere 30 millilitri di soluzione di saccarosio sterile 0,32 molari. Utilizzare un omogeneizzatore di vetro da 50 millilitri per macinare il fazzoletto per due minuti. Per ottenere un omogeneizzato di tessuto cerebrale liscio. Diluire l'omogeneizzato di tessuto cerebrale a 90 millilitri con una soluzione di saccarosio sterile 0,32 molari e mescolare accuratamente. Aggiungere 20 millilitri di soluzione sterile di saccarosio 0,83 molare in sei provette sterili per ultracentrifuga in polipropilene a parete sottile. Quindi erogare lentamente 15 millilitri della miscela cerebrale nella parte superiore dei tubi. Livellare i volumi con una soluzione di saccarosio sterile 0,32 molari. Per raccogliere i detriti grezzi di mielina, prima pre-raffreddare e ultra centrifugare il rotore a quattro gradi Celsius. Centrifugare il campione a 75.000 G per 45 minuti, quindi raccogliere i detriti di mielina dall'interfaccia tra le due densità di saccarosio utilizzando una pipetta sterile per pascoli. Per la prima separazione isotonica e purificazione, trasferire la soluzione di detriti di mielina raccolta in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Regolare il volume a 35 millilitri con PBS sterile pre-raffreddato e trasferire in una nuova provetta omogeneizzatrice. Dopo l'omogeneizzazione per tre minuti, distribuire uniformemente l'omogeneizzato di detriti di mielina in sei provette sterili da 38,5 millilitri in polipropilene a parete sottile. Prelevare il volume con PBS sterile, quindi centrifugare. Per la seconda separazione isotonica e purificazione, risospendere il pellet bianco solido in 10 millilitri di PBS sterile pre-raffreddato per ottenere una sospensione di detriti di mielina. Distribuire la sospensione nelle provette per ultracentrifuga come prima e centrifugare. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante. Risospendere il pellet bianco solido in sei millilitri di PBS sterile. Dividere la sospensione di detriti di mielina in sei provette da centrifuga da 1,5 e centrifugare di nuovo. Infine, risospendere il pellet in 100 microlitri di PBS sterile pre-raffreddato dopo aver scartato il surnatante. Scongelare i detriti di mielina necessari a quattro gradi Celsius, o in acqua ghiacciata, e centrifugare come prima per 10 minuti. Risospendere i detriti di mielina in 200 microlitri di soluzione CFSE 50 micromolari. Incubare la sospensione a temperatura ambiente al buio per 30 minuti, quindi centrifugare nuovamente. Scartare il surnatante, quindi lavare i campioni tre volte con 500 microlitri di PBS sterile. Risospendere i detriti di mielina in 100 microlitri di PBS sterile pre-raffreddato per ottenere una sospensione di detriti di mielina marcati in fluorescenza. Conservare il campione a -80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Per la stimolazione magnetica ripetuta in vitro, impostare la frequenza di trattamento a 20 hertz, l'intensità del trattamento all'1% dell'intensità massima di uscita e il tempo di stimolazione a cinque secondi. Includere un periodo di riposo di 20 secondi e somministrare 600 impulsi in un singolo tempo di trattamento di 2,5 minuti. Dopo aver predeterminato i parametri di stimolazione magnetica, fissare la direzione della bobina perpendicolarmente al suolo e orientarla verso l'alto. Sterilizzare la bobina di stimolazione magnetica con alcol per prevenire la contaminazione cellulare. Dopo aver aggiunto 50 micromolari di CFSE, piastra 1.000 cellule BV-2 in piastre a 24 pozzetti per una notte, quindi aspira il vecchio terreno con una pipetta e aggiunge immediatamente un terreno fresco privo di siero. Cambiare il terreno in un terreno privo di siero e trattare le cellule con un microgrammo per millilitro di lipopolisaccaride per 12 ore. Dopo 12 ore di intervento con lipopolisaccaridi, aggiungere 100 microgrammi per millilitro di detriti di mielina al terreno per la co-coltura al buio. Sottoporre le cellule a ripetute stimolazioni magnetiche, come dimostrato in precedenza. Spruzzare dell'alcol sulla piastra per sterilizzarla prima di rimetterla nell'incubatrice. Dopo un periodo di co-coltura con frammenti di mielina, lavare delicatamente i detriti di mielina non assorbiti con PBS. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 15 minuti. Successivamente, aggiungere 150 microlitri di PBS contenenti il 10% di albumina sierica d'asina e lo 0,3% di Triton X-100 ai pozzetti e incubare. Dopo aver lavato i pozzetti con PBS, aggiungere una soluzione di anticorpi primari in un rapporto da 100 a 200 nei pozzetti e incubare al freddo. Quindi, incubare le cellule in un anticorpo secondario in un rapporto compreso tra 100 e 300 per due ore a temperatura ambiente prima di eseguire l'imaging con un microscopio confocale. Le cellule della microglia BV-2 hanno mostrato una significativa riduzione della fagocitosi dei detriti mielinici dopo il trattamento con lipopolisaccaridi. che è stato invertito dopo ripetuti interventi di stimolazione magnetica. L'analisi quantitativa ha confermato una significativa diminuzione dell'area dei detriti di mielina all'interno delle cellule BV-2 nel gruppo lipopolisaccaridico rispetto al gruppo di controllo, con un notevole aumento nel gruppo trattato con lipopolisaccaridi stimolato magneticamente. La percentuale di microglia IBA-1 positiva co-localizzata con detriti mielinici era significativamente più bassa nel gruppo LPS rispetto al gruppo di controllo, mentre la stimolazione magnetica aumentava significativamente questa percentuale. È stato osservato un aumento tempo-dipendente della fagocitosi microgliale con il gruppo stimolato magneticamente trattato con lipopolisaccaridi per il nostro gruppo che mostrava un assorbimento di detriti mielinici significativamente più elevato.