Criosezione e immunocolorazione del tessuto dell'orecchio interno del topo: dagli stadi embrionali a quelli adulti

La mia ricerca si concentra sul neurosviluppo della coclea. In particolare, mi propongo di scoprire i meccanismi alla base della formazione di SNAPS all'interno della coclea e di studiare la connessione tra la malattia di Alzheimer e la perdita dell'udito. L'imaging dal vivo e gli strumenti genetici stanno migliorando la nostra capacità di studiare le strutture cocleari e i circuiti neurali in modo più dettagliato, fornendo informazioni più approfondite sulla resilienza e la disfunzione del sistema uditivo. Pubblicando questo protocollo, vogliamo aiutare i ricercatori che sono nuovi alla scienza degli auditor, in particolare quelli che non hanno mai lavorato con la coclea prima. Questa guida spiega passo dopo passo come preparare campioni di orecchio interno da topi embrionali, neonati e adulti. Il nostro obiettivo è quello di semplificare gli esperimenti sull'orecchio interno e garantire che i risultati siano affidabili e coerenti. L'immunocolorazione in sezione trasversale presenta diversi vantaggi rispetto ad altri metodi, come l'immunocolorazione a montaggio intero. Conserva bene le proteine e gli acidi nucleici e crea sezioni sottili, quasi 2D, che rendono le misurazioni più accurate e coerenti. Questo metodo mantiene inoltre intatti e visibili tutti i tipi di cellule cocleari, migliorando il culto dell'immunocolorazione. A differenza delle preparazioni a montaggio intero, il sezionamento trasversale preserva strutture importanti, come il legamento spirale, la stria vascolare, la membrana di Reissner e la membrana tettorica.

[Istruttore] Per iniziare, posiziona il topo giovane soppresso su una piattaforma chirurgica. Usando le forbici da dissezione fine, praticare con cura un'incisione sulla linea mediana lungo il cuoio capelluto, partendo dal collo ed estendendosi verso il muso. Quindi, posiziona la lama inferiore delle forbici sul forame magno e la lama superiore sul cranio. Tagliare la metà superiore del cranio fino al naso per completare il secondo taglio. Estrarre le forbici dalla testa parzialmente incisa. Posiziona la lama inferiore delle forbici nella parte inferiore del cranio e la lama superiore nel forame magno. Tagliare la metà inferiore della testa fino al naso per completare il terzo taglio. Usando pinze sottili e forbici, stacca con cura tutti i tessuti molli che circondano l'osso temporale, inclusi cervello, muscoli e tessuto connettivo. Quindi, posizionare le mezze teste di topo nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente PBS. Sostituire il PBS con una soluzione di paraformaldeide al 4% per il fissaggio e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, sciacquare il fazzoletto tre volte per cinque-10 minuti con PBS. Individua l'osso temporale o la capsula dell'orecchio interno all'interno della metà della testa del topo. Usando una pinza sottile, staccare con cura il tessuto molle che circonda la capsula dell'orecchio interno. Una volta allentato, tagliare il tessuto attorno alla capsula dell'orecchio interno. Quindi applicare una leggera pressione sull'area circostante la capsula auricolare interna utilizzando una pinza per liberarla completamente. Conservare i campioni dell'orecchio interno in PBS a quattro gradi Celsius. Per iniziare, posiziona il topo adulto soppresso su una piattaforma chirurgica. Usando le forbici da dissezione affilate, praticare un'incisione sulla linea mediana lungo il cuoio capelluto, partendo dal collo ed estendendosi verso il muso. Piegare la pelle all'indietro per esporre il cranio durante il primo taglio. Posiziona la lama inferiore delle forbici sul forame magno e la lama superiore sul cranio. Tagliare la metà superiore del cranio fino al naso per completare il secondo taglio. Estrarre le forbici dalla testa parzialmente incisa. Posizionare la lama inferiore alla base del cranio e la lama superiore al forame magno. Taglia la metà inferiore della testa fino al naso lungo la linea mediana, evitando le orecchie interne. Per ogni metà della testa, usa pinze e forbici per staccare i tessuti molli che circondano l'osso temporale, inclusi il cervello, i muscoli e il tessuto connettivo. Quindi, arriccia al contrario il tessuto del cranio con le dita e usa il pollice per applicare una leggera pressione sulla parte inferiore dell'osso temporale. Allenta gradualmente l'osso dai suoi attacchi circostanti. Una volta rimossa la capsula auricolare interna, sciacquarla accuratamente con PBS. Mettere al microscopio una capsula Sylgard riempita con paraformaldeide al 4%. Posizionare una singola capsula auricolare interna nel piatto. Esamina l'orecchio interno alla ricerca di eventuali tessuti molli o ossa attaccati e rimuovilo delicatamente. Identificare la finestra ovale e rimuovere delicatamente la staffa con una pinza. Quindi, usando una pinza fine, apri un piccolo foro all'apice della coclea. Utilizzando una pipetta P20 riempita con paraformaldeide al 4%, sciacquare la coclea per garantire che i fluidi, come il sangue diluito o l'endolinfa, escano attraverso la finestra ovale. Trasferire la coclea fissa in una piastra a 24 pozzetti riempita con paraformaldeide al 4%. Segna il tempo e incuba per 30-60 minuti agitando delicatamente usando un bilanciere o un nutatore. Dopo l'incubazione, sciacquare il campione tre volte per cinque-10 minuti con PBS. Dopo il risciacquo finale, posizionare la coclea in EDTA da 1,25 millimolari e lasciarla oscillare per due o tre giorni a quattro gradi Celsius. Dopo il trattamento con EDTA, sciacquare la coclea tre volte per cinque minuti con PBS. Per iniziare, posizionare la capsula dell'orecchio interno sezionata in una soluzione di saccarosio al 10% e incubare a temperatura ambiente per due ore. Dopo l'incubazione, sostituire la soluzione di saccarosio al 10% con saccarosio al 20% e incubare per altre due ore. Quindi sostituire la soluzione di saccarosio al 20% con saccarosio al 30% e incubare il campione per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere metà della soluzione di saccarosio al 30%. Riempire lo spazio con la temperatura di taglio ottimale o con il composto OCT e lasciare che il campione formuli per 30 minuti o due ore. Trasferire i campioni in criostampi etichettati riempiti con composto OCT. Controllare l'orientamento della coclea nel crioblocco incorporato. Assicurarsi che l'orecchio interno sia in tono interno; Il lato concavo è rivolto verso i lati stretti del criostampo per sezioni trasversali cocleari standard. Quindi, metti il ghiaccio secco in un piccolo contenitore e aggiungi da cinque a 10 millilitri di dimetilbutano. Posizionare i criostampi contenenti OCT e il campione sul ghiaccio secco gorgogliante per congelare rapidamente il blocco. Trasferire i crioblocchi nella camera di un criostato pre-raffreddato a meno 20 gradi Celsius. Lasciare equilibrare i campioni per 30-60 minuti. Usando una matita o una penna, segnare il lato del crioblocco corrispondente alla posizione cocleare per garantire il corretto orientamento per il sezionamento. Quindi, aggiungi una piccola pozza di OCT al mandrino e posiziona il blocco criogenico su di esso, assicurandoti che il lato largo senza il segno della matita sia rivolto verso il basso. Posizionare il mandrino contenente l'OCT e il campione nella camera del criostato raffreddata, lasciando che l'OCT si congeli completamente. Dopo alcuni minuti, posizionare il mandrino con il campione sul supporto del mandrino con il segno della matita rivolto a destra o a sinistra. Su un criostato, tagliare il blocco utilizzando un'impostazione di 40 micrometri fino a quando il tessuto diventa evidente. Una volta che il tessuto è evidente, prelevare una sezione di 12 micrometri utilizzando vetrini progettati per la criosezione. Controllare la posizione della sezione al microscopio. Se ci si avvicina alle spire cocleari, continuare a prelevare sezioni di 12 micrometri, controllando periodicamente la posizione fino a quando tutte le spire cocleari sono state sezionate.