Isolamento di popolazioni di cellule mieloidi ed epiteliali vive dal polmone di topo
31 gennaio 2025
Questo protocollo descrive in dettaglio l'isolamento di popolazioni vive immunitarie e non immuni dal polmone di topo allo stato stazionario e in seguito all'infezione influenzale. Fornisce inoltre strategie di gating per l'identificazione di sottogruppi di cellule epiteliali e mieloidi.
Studiamo la riparazione polmonare dopo un'infezione virale. Il nostro obiettivo è comprendere i meccanismi con cui le cellule immunitarie mediano la riparazione epiteliale e come il rimodellamento dopo un danno virale e la successiva riparazione possano influire su future patologie della malattia. Questo protocollo affronta l'incompatibilità dei digestati polmonari ottimizzati per le cellule epiteliali e stromali o per le cellule immunitarie.
La nostra ricerca richiede l'isolamento di cellule vitali sia dai compartimenti immunitari che da quelli non immunitari. Inoltre, abbiamo proposto una strategia di gating per sottogruppi epiteliali e macrofagi, che speriamo possa giovare al campo. Il nostro laboratorio studia il crosstalk tra cellule immunitarie ed epiteliali nel tratto respiratorio in condizioni di stato stazionario e in risposta alle sfide ambientali.
Il nostro obiettivo finale è determinare il modo migliore per modulare questa comunicazione per migliorare la riparazione dei tessuti e prevenire lo sviluppo della malattia. Per iniziare, spruzza il mouse con etanolo al 70%. Usando le forbici chirurgiche sottili e la pinza numero sette, praticare un'incisione nell'addome e tagliare lateralmente il peritoneo.
Fai un piccolo taglio nel diaframma per rilasciare il vuoto. Quindi, tagliare il diaframma e la gabbia toracica inferiore dalla cavità corporea per esporre i polmoni e il cuore. Utilizzando una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 27, perfondere i polmoni con cinque millilitri di EDTA da due millimolari in DPBS.
Tagliare verticalmente attraverso lo sterno e lungo i lati per aprire la gabbia toracica ed esporre la trachea. Usa le forbici sottili e la pinza numero sette per rimuovere quanto più muscolo e tessuto connettivo possibile senza perforare la trachea o i polmoni. Successivamente, avvolgere la trachea con una sutura 2/0, posizionandola come per legarla, ma non stringerla.
Fare una tacca laterale nella trachea e inserire il catetere. Quindi, tirare la sutura per fissare il catetere in posizione. Gonfiare i polmoni con un millilitro di DPBS usando una siringa.
Quindi, tirare lentamente indietro la siringa per estrarre il DPBS. Rigonfiare i polmoni con lo stesso DPBS e, di nuovo, tirare indietro la siringa per raccogliere il liquido di lavaggio broncoalveolare, o BAL. Scollegare la siringa dal catetere lasciando il catetere inserito.
Erogare la valvola raccolta in una provetta per microcentrifuga. Quindi, riempire la stessa siringa da un millilitro con un millilitro di dispasi. Collegare la siringa al catetere e gonfiare i polmoni con la dispasi.
Durante la rimozione del catetere, stringere la sutura attorno alla trachea per evitare perdite di dispasi. Usando le forbici, taglia lateralmente la trachea. Rimuovere i polmoni dalla cavità corporea tagliando il tessuto connettivo lungo la parte posteriore della gabbia toracica mentre si tirano i polmoni e la trachea verso l'alto.
Quindi, rimuovi il cuore dai polmoni. Metti i polmoni in cinque millilitri di DPBS sul ghiaccio. Centrifugare la valvola a 400 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Con una pipetta, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 100 microlitri di RPMI. Per iniziare, seziona i cinque lobi dei polmoni prelevati dal topo e scarta il tessuto connettivo. Tritare il tessuto polmonare sezionato con le forbici per un minuto su un vetrino.
Utilizzando le forbici da dissezione, trasferire il tessuto polmonare tagliato in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Quindi, aggiungere tre millilitri di miscela di digestato e pipettare la miscela di digestato polmonare su e giù due o tre volte. Infine, aggiungere il pellet di cella recuperato dal BAL risospeso in RPMI.
Posizionare il tubo con un angolo di 45 gradi in un agitatore orbitale impostato a 140 giri/min a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere la provetta dallo shaker e metterla sul ghiaccio. Pipettare la miscela di digestato polmonare su e giù cinque o sei volte.
Filtrare la miscela attraverso un colino cellulare da 70 micrometri in una nuova provetta da 50 millilitri. Lavare le cellule rimanenti attraverso il filtro e neutralizzare gli enzimi con 10 millilitri di FBS al 5% nel mezzo RPMI. Centrifugare il campione a 600 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Aspirare il surnatante utilizzando un aspiratore a vuoto. Risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tampone di lisi ACK e incubare per tre minuti a temperatura ambiente per lisare i globuli rossi. Quindi, aggiungere nove millilitri di PBS e pipettare su e giù per mescolare la soluzione.
Anche in questo caso, centrifugare il campione e utilizzare un aspiratore a vuoto per rimuovere il surnatante, quindi risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tampone di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza. Filtrare la sospensione attraverso una rete di 64 micrometri in una provetta da microcentrifuga per l'analisi della citometria a flusso.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo protocollo descrive l'isolamento di popolazioni immunitarie e non immunitarie vitali dal polmone del topo in condizioni di stato stazionario e dopo infezione da influenza. Fornisce strategie di selezione per identificare sottoinsiemi di cellule epiteliali e mieloidi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- Lo studio si concentra sui meccanismi di riparazione polmonare dopo infezione virale.
- Comprendere il ruolo delle cellule immunitarie nella riparazione dell'epitelio è fondamentale.
- La ricerca affronta le sfide legate all'isolamento di cellule vitali da diversi compartimenti polmonari.
- Indaga le interazioni tra cellule immunitarie ed epiteliali nel tratto respiratorio.
Scopo dello studio
- Isolare cellule immuni e non immuni vitali dai polmoni del topo.
- Sviluppare una strategia di gating per identificare sottoinsiemi cellulari specifici.
- Esplorare l'impatto del danno virale e della riparazione sulle patologie delle malattie future.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di popolazioni vive di cellule immunitarie e non immunitarie dai polmoni del topo.
- Strategie di selezione per identificare i sottoinsiemi di cellule epiteliali e mieloidi.
- Analisi dei meccanismi di riparazione polmonare dopo infezione da influenza.
- Valutazione della comunicazione crociata tra cellule immunitarie ed epiteliali.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di distinte popolazioni di cellule immunitarie e non immunitarie.
- Identificazione di specifici sottogruppi di cellule epiteliali e di macrofagi.
- Approfondimenti sui meccanismi di riparazione polmonare successivi a infezione virale.
- Contributo alla comprensione di future patologie correlate a lesioni polmonari.
Conclusioni
- Il protocollo migliora la capacità di studiare le risposte immunitarie polmonari.
- Fornisce strumenti preziosi per indagare i meccanismi di riparazione epiteliale.
- I risultati potrebbero orientare future ricerche sulle malattie respiratorie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento simultaneo di popolazioni vitali di cellule mieloidi ed epiteliali dai polmoni del topo consente un'analisi approfondita della comunicazione intercellulare nei modelli di malattie respiratorie. Questa capacità favorisce la riduzione dei rischi meccanicistici e aumenta la previsione nell'ambito della validazione del bersaglio e delle fasi iniziali della scoperta. Il metodo migliora le decisioni strategiche fornendo sospensioni cellulari singole di alta qualità e multiparametriche per analisi successive.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette lo studio diretto delle interazioni immuno-epiteliali fondamentali per la validazione degli obiettivi nei modelli di malattie polmonari.
- Consente la riduzione del rischio meccanicistica permettendo la valutazione funzionale sia dei compartimenti immunitari che non immunitari.
- Facilita l'analisi guidata da ipotesi dei percorsi di riparazione e rimodellamento dopo un danno.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce sospensioni cellulari monocellulari validate, adatte per flussocitometria e flussi di lavoro di screening basati su FACS.
- Migliora la riproducibilità dei saggi standardizzando l'isolamento cellulare in popolazioni immunitarie ed epiteliali.
- Permette strategie quantitative di gating per l'identificazione robusta di sottopopolazioni cellulari in condizioni sia naive che patologiche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli murini pertinenti alle malattie per la scoperta traslazionale di biomarcatori nella ricerca respiratoria.
- Permette la continuità dalla scoperta meccanicistica alla validazione preclinica, consentendo l'analisi delle risposte specifiche per cellula all'infezione o al danno.
- Riduce l'ambiguità biologica nei modelli preclinici catturando popolazioni cellulari diverse in un unico flusso di lavoro.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e la ricerca preclinica, supportando i flussi di lavoro dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto leader in modelli di malattie respiratorie.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi sul dialogo immuno-epiteliale e l'individuazione di vie coinvolte nel ripristino polmonare.
- Screening: Fornisce dati quantitativi riproducibili sui sottogruppi cellulari per analisi successive di composti o screening genetici.
- Analisi: Offre output di citometria a flusso multiparametrica per l'analisi comparativa tra condizioni patologiche e di controllo.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati meccanicistici a endpoint preclinici in modelli di infezione, allergia, fibrosi e cancro.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo standardizzato e scalabile, adattabile in diversi programmi di ricerca respiratoria.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sulle malattie polmonari.
- Valore operativo: Ottimizza l'isolamento cellulare, migliora la riproducibilità e favorisce l'analisi ad alto rendimento.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione consentendo la generazione precoce di dati robusti e multiparametrici nel flusso di lavoro.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei bersagli e dei modelli da avanzare, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione del polmone murino, digestione enzimatica e analisi mediante citometria a flusso.
- Necessita dell'accesso a strumentazione FACS e infrastruttura analitica per il gating multiparametrico.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le strategie di gating e i protocolli di gestione dei campioni.
- È adattabile a diversi modelli murini di malattie respiratorie, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione per specifici endpoint.
- La vitalità e il rendimento cellulare dipendono da un'esecuzione precisa dei passaggi di dissociazione enzimatica e meccanica.
