Riprogrammazione del modello di macrofagi derivati da monociti umani per saggi in vitro

La nostra ricerca ha studiato il lignaggio dei monociti e dei macrofagi, sottolineando la sua notevole plasticità e capacità di integrare più segnali dall'ambiente per modellare la risposta effettrice durante l'infiammazione, la riparazione dei tessuti e le infezioni. I macrofagi si trovano in tutto il corpo e coordinano l'inizio e la risoluzione dell'immunità innata e adattata che influisce sulla patologia protetta e immuno-mediata. La riprogrammazione dei macrofagi è la caratteristica più promettente in questo campo.

La tecnologia omica emergente ha rivoluzionato la nostra comprensione della biologia dei macrofagi, fornendo informazioni sulla loro diversità fenotipica, le caratteristiche funzionali, il loro potenziale di programmazione e l'origine dello sviluppo di queste cellule. Il principale ostacolo e insidia nella scoperta della differenziazione e della polarizzazione dei macrofagi sono le condizioni sperimentali e i protocolli eterogenei in tutta la letteratura e la mancanza di consenso nella definizione del termine macrofagico. Dimostriamo l'effetto di riprogrammazione del farmaco e del mediatore lipidico sulla polarizzazione dei macrofagi e sviluppiamo un modello 3D in vitro di interazione tra cellule di macrofagi e glioblastoma.

Inoltre, abbiamo dimostrato che le piastrine autorizzano la differenziazione dei macrofagi derivati dai monociti al fenotipo N1. Per iniziare, mettere i campioni di sangue periferico anticoagulato in una centrifuga. Centrifugare a 200 G per 15 minuti a temperatura ambiente.

Osservare la separazione del plasma ricco di piastrine in alto e della frazione cellulare, compresi i globuli rossi e bianchi, in basso. Diluire la frazione cellulare ottenuta dalla prima centrifugazione con PBS sterile preriscaldato a temperatura ambiente. Omogeneizzare delicatamente la soluzione prima di procedere con la centrifugazione in gradiente di densità Ficoll-Hypaque.

Trasferire 15 millilitri di Ficoll-Hypaque in una provetta sterile da 15 millilitri. Aggiungere con cautela e lentamente 30 millilitri di sangue diluito sopra il Ficoll, garantendo una miscelazione minima tra le fasi. Centrifugare la provetta contenente il Ficoll e il sangue diluito a 600G per 25 minuti a temperatura ambiente.

Con una pipetta sterile Pasteur da tre millilitri, rimuovere parte dello strato superiore giallo. Raccogliere con cura l'interfaccia tra lo strato giallo e lo strato di Ficoll con una pipetta Pasteur sterile. Trasferire le cellule mononucleate del sangue periferico raccolte, o PBMC, in una nuova provetta da 15 millilitri contenente almeno tre millilitri di PBS sterile.

Rabboccare il tubo con PBS sterile per raggiungere un volume totale da 12 a 15 millilitri. Quindi centrifugare il campione a 600 G per 10 minuti. Quindi, abbassa la sospensione PBMC a 300 G per cinque minuti a 8-10 gradi Celsius.

Risospendere le cellule nel volume desiderato di PBS freddo sterile con il 2% di FBS. Mantieni le celle a 4 gradi Celsius fino al passaggio successivo. Trasferire il volume desiderato di sospensione PBMC in un tubo a fondo tondo in polistirene da cinque millilitri.

Quindi aggiungere 10 microlitri di cocktail a selezione positiva per ogni 100 microlitri di sospensione cellulare. Mescolare accuratamente la sospensione prima di incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi, pipettare 10 microlitri di nanoparticelle magnetiche per 100 microlitri di sospensione cellulare.

Pipettare energicamente su e giù più di cinque volte per garantire una sospensione uniforme delle nanoparticelle magnetiche. Dopo un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente, aggiungere PBS contenente FBS e EDTA alla sospensione per portare il volume totale a 2,5 millilitri. Pipettare delicatamente le cellule su e giù due o tre volte.

Inserire il tubo nel selezionatore di magneti e lasciarlo riposare indisturbato per cinque minuti. Capovolgere il magnete insieme al tubo con un movimento continuo. Tenere il magnete e il tubo capovolti per due o tre secondi prima di riportarli in posizione verticale.

Rimuovere il tubo dal magnete, quindi aggiungere nuovamente 2,5 millilitri di tampone PBS-FBS-EDTA nel tubo. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù due o tre volte per mescolarla. Reinserire il tubo nel magnete e metterlo da parte per cinque minuti.

Con un movimento continuo, invertire nuovamente il magnete e il tubo, scartando la frazione surnatante. Rimuovere il tubo dal magnete e risospendere le celle in un volume appropriato di PBS-FBS senza EDTA. Le celle selezionate positivamente sono ora pronte per l'uso.

Ora aggiungi il tampone PBS-FBS alle cellule CD14 selezionate, portando il volume totale a 12-14 millilitri per diluire l'EDTA rimanente. Centrifugare a 600G per 10 minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere i monociti CD14 selezionati positivamente in due millilitri di tampone PBS-FBS.

Conta le celle utilizzando un contatore automatico di celle. Mantenere le cellule sul ghiaccio fino alla preparazione della coltura. Per la coltura, risospendere il pellet a una concentrazione di un milione di cellule per millilitro in terreno RPMI 1640 integrato.

Pipettare 250 microlitri della sospensione cellulare preparata in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti. Aggiungere 250 microlitri di terreno RPMI integrato con antibiotici contenente 50 nanogrammi per millilitro di fattore stimolante le colonie di macrofagi in ciascun pozzetto. Incubare la piastra di coltura cellulare in un incubatore umidificato per avviare la differenziazione dei macrofagi.

Il quarto giorno di differenziazione dei macrofagi, sostituire metà del terreno di coltura da ciascun pozzetto. Aggiungere citochine o reagenti per le condizioni di polarizzazione desiderate e continuare la coltura per altri tre giorni. Raccogliere i monociti derivati dai macrofagi il settimo giorno per la caratterizzazione fenotipica.

I macrofagi M1 indotti dall'interferone gamma-plus lipopolisaccaride hanno mostrato la più alta espressione di CD64, l'assenza di CD206 e bassi livelli di CD163 e MERTK. I macrofagi M2a indotti dall'interleuchina 4 erano caratterizzati da un aumento dell'espressione di CD206 e da una riduzione dei livelli di CD64, CD163 e MERTK. I macrofagi M2c indotti dall'interleuchina 10 o dal desametasone hanno mostrato un aumento dell'espressione di CD163 e CD14, livelli intermedi di CD64 e un aumento dell'espressione di MERKT.