Name: Rilevamento multiplex dellespressione genica nel cervello intatto di Drosophila mediante ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Scopri la tecnica EASI-FISH per visualizzare l'espressione genica nel cervello di Drosophila mediante ibridazione in situ iterativa assistita da espansione. Questo metodo consente analisi ad alta risoluzione dei profili di espressione neuronale.

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Ringraziamo Paul Tillberg per i consigli sulle dinamiche della microscopia ad espansione, Christina Christoforou per l'aiuto con le dissezioni cerebrali e Geoffrey Meissner per il feedback critico. Ringraziamo inoltre Tanya Wolff e Gerry Rubin, così come Geoffrey Meissner e Wyatt Korff, per averci permesso di includere i risultati che sono stati generati nell'ambito di due studi più ampi. Tutto il lavoro è stato svolto presso il Janelia Research Campus e supportato dall'Howard Hughes Medical Institute attraverso fondi ai team di progetto MultiFISH e Fly-eFISH, a Gerry Rubin e alle risorse tecniche del progetto.

Questo protocollo è stato eseguito su femmine adulte (di 5-6 giorni) di Drosophila melanogaster, ma qualsiasi sesso o specie di Drosophila è applicabile. Per le ricette di ancoranti in gel, vedere la Tabella supplementare 1; per la ricetta del gel, Tabella supplementare 2; e per altri reagenti EASI-FISH, Tabella supplementare 3. Per una guida quotidiana ai materiali e ai reagenti, vedere la Tabella supplementare 4. Per il supporto del gel per microscopio a foglio luminoso, vedere il file supplementare 1. La Figura 1A-C mostra una rappresentazione schematica dell'incorporazione del cervello nei gel prima dell'espansione e dell'ibridazione della sonda (passaggi da 2.1 a 3.8). La Figura 1D è una fotografia dei cervelli incorporati, La Figura 1E mostra un supporto in gel per la microscopia a foglio di luce e La Figura 1F raffigura la cronologia di un tipico esperimento. I dettagli commerciali dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono riportati nella Tabella dei Materiali.
1. Dissezione e fissazione del cervello di mosca
<ol>
	<li>Sezionare cervelli di mosca o SNC in terreno S2 freddo (per ulteriori dettagli sulla dissezione, vedere reference21)</li>
	<li>Per fissare il cervello, aggiungere fino a 20 cervelli o 10 SNC a 2 ml di PFA/PBS freddo al 4% e incubare per una notte su un nutatore a 4°C. 
	ATTENZIONE: Il PFA è dannoso se ingerito o inalato, irritante per la pelle e gli occhi e può essere cancerogeno.</li>
	<li>Sciacquare il campione (1x) con 2 mL di PBT freddo (0,5%, vedere la Tabella supplementare 4), quindi lavare il campione con 2 mL di PBT freddo (4x) per 15 minuti su un nutatore a 4 °C.</li>
	<li>Sciacquare il campione (1x) con 2 mL di EtOH freddo al 70%. Conservare il cervello in 2 mL di EtOH al 70% a 4 °C per un massimo di 6 mesi.</li>
</ol>
2. Montaggio dei cervelli e aggiunta di RNA e linker proteici (Giorno 1)
NOTA: Indossa sempre i guanti e pulisci costantemente l'attrezzatura e lo spazio di lavoro con RNase Away. I guanti sono necessari (1) per tenere le RNasi lontane dai campioni e (2) come protezione da diversi reagenti che rappresentano un pericolo per la salute.
<ol>
	<li>Preparare le camere di gel strofinando un vetrino non caricato con un reagente di decontaminazione RNasi. Rimuovere la pellicola opaca che protegge l'adesivo dalla guarnizione in silicone, far aderire la guarnizione (con un massimo di 4 camere) al vetrino e rivestire ogni superficie della camera con 1 μL di polilisina utilizzando un puntale per pipetta P20. Asciugare all'aria e ripetere il processo. 
	NOTA: Il passaggio 2.1 può essere eseguito il giorno prima.</li>
	<li>Trasferire il cervello in una provetta PCR da 0,2 ml (fino a 4 cervelli per provetta) e reidratare per (2x) 5 minuti in 150 μL di PBT (0,1%) e (2x) per 5 minuti in PBS.</li>
	<li>Per montare i cervelli, aggiungere 40 μL di PBS per camera, quindi attaccare delicatamente i cervelli in fila al centro della camera con una pinzetta sottile, lasciando un po' di spazio tra i cervelli (vedi Figura 1D). È possibile montare fino a 6 cervelli o 2 SNC per camera.</li>
	<li>Rimuovere il PBS e aggiungere immediatamente 50 μL di tampone MOPS da 20 mM. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Mentre i cervelli si equilibrano nel tampone MOPS, scongelare le soluzioni madre di Melphalan-X e Ac-X e preparare 75 μL di soluzione di Melphalan-X/Ac-X per camera (diluire lo stock di Melphalan-X 1:1 con il tampone MOPS e aggiungere Ac-X a 1:100). Vorticare e girare brevemente per raccogliere la soluzione; Cronometrare la preparazione in modo che la soluzione sia pronta alla fine del tempo di incubazione di 30 minuti, non prima. 
	ATTENZIONE: Melfalan-X è dannoso se ingerito o inalato, irritante per la pelle e gli occhi e può essere cancerogeno.</li>
	<li>Rimuovere tutto il tampone MOPS e aggiungere 50 μL di soluzione Melphalan-X/Ac-X.</li>
	<li>Coprire la camera posizionando un vetrino coprioggetti sulla parte superiore, ma non utilizzare l'adesivo per guarnizioni per sigillare. Collocare la camera in una scatola umidificata e incubare al riparo dalla luce per una notte a RT.</li>
</ol>
3. Gelificazione e digestione della proteinasi K (Giorno 2)
<ol>
	<li>Rimuovere con cautela il vetrino coprioggetti e Melfalan-X/Ac-X e lavare i cervelli montati (2x) per 2 minuti con 100 μL di PBT (0,1%) e (1x) per 2 min con 100 μL di PBS.</li>
	<li>Scongelare la soluzione TREx-1000, 4HT, TEMED e APS e mantenere in posizione di ghiaccio. 
	NOTA: TREx-1000 può precipitare a -20 °C; vortice bene per dissolversi completamente dopo lo scongelamento. 
	ATTENZIONE: Questi reagenti sono dannosi o tossici se ingeriti o inalati, così come irritanti per la pelle e gli occhi.</li>
	<li>Preparare la soluzione in gel miscelando TREx-1000 con 4HT, TEMED e APS in un rapporto di 94:2:2:2. Vorticare e mantenere sul ghiaccio. Per ogni camera, preparare 150 μL di soluzione di gel.</li>
	<li>Rimuovere il PBS dalla camera con la punta di una pipetta e rimuovere con cura il PBS rimanente con un panno privo di lanugine. Per ogni camera, aggiungere immediatamente 40 μL di soluzione di gel sopra il cervello. Incubare a 4 °C per 10 min.</li>
	<li>Togliere la soluzione di gel e aggiungere 40 μL di soluzione di gel fresco, incubando a 4 °C per altri 10 min. 
	NOTA: Raccogliere la soluzione di scarto del gel in una provetta da microcentrifuga e polimerizzare prima di scartarla.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di gel e staccare la pellicola protettiva trasparente dall'adesivo superficiale della guarnizione. Aggiungere gli ultimi 45 μl di soluzione di gel fresco, posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti sulla camera ed evitare di intrappolare bolle d'aria. Premere il vetrino coprioggetti per sigillare la camera e incubare a 4 °C per 10 minuti (per un totale di 30 minuti di equilibratura a 4 °C).</li>
	<li>Polimerizzare il gel a 37 °C per 1,5 h.</li>
	<li>Una volta che i gel si saranno solidificati, lasciateli raffreddare sulla panca per qualche minuto. Togliere con cautela il vetrino coprioggetti e rimuovere la guarnizione in silicone con una nuova lametta. Quindi, taglia il gel in un rettangolo e taglia l'angolo in alto a destra per monitorare l'orientamento del campione.</li>
	<li>Rimuovere i gel dal vetrino con un pennello fine inumidito con una piccola quantità di ProK Buffer e trasferirli singolarmente in provette da microcentrifuga da 2 mL.</li>
	<li>Incubare ogni gel con 500 μL di tampone ProK e 5 μL di enzima ProK (1:100) a 37 °C per una notte.</li>
</ol>
4. Digestione del DNA e ibridazione della sonda (Giorno 3)
<ol>
	<li>Lavare i gel (3 volte) per 10 minuti con 1 ml di PBS a RT. 
	NOTA: Utilizzare pipette di trasferimento a punta fine per evitare di danneggiare il gel durante la sostituzione delle soluzioni.</li>
	<li>Incubare i gel per 30 minuti in 1 mL di tampone DNase1 a 37 °C.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL di enzima DNase1 a 450 μL di tampone DNasi. Mescolare delicatamente, ma non vortice. Incubare ciascun gel in 500 μL di DNase1 per 2 ore e 37 °C. Lavare (4x) 15 min con 1 mL di PBS a RT. 
	NOTA: I gel possono essere conservati in 5x SSC a 4 °C prima o dopo il digerimento/lavaggio della DNasi per diverse settimane.</li>
	<li>Ibridazione di disgelo (hyb) e tampone di lavaggio della sonda. Incubare i gel in 500 μL di tampone hyb senza sonde per 30 minuti a 37 °C. 
	ATTENZIONE: L'hyb e il tampone di lavaggio della sonda contengono formammide, che si sospetta causi il cancro.</li>
	<li>Diluire le sonde 1:100 in tampone hyb (10 nM), preparando 300 μl per gel. Incubare i gel con il tampone hyb e le sonde per una notte a 37 °C. Mantenere il tampone di lavaggio della sonda e il PBS a 37 °C.</li>
</ol>
5. Lavaggi delle sonde (Giorno 4)
<ol>
	<li>Lavare i gel (3 volte) per 30 minuti con 750 μL di tampone di lavaggio della sonda a 37 °C.</li>
	<li>Lavare i gel (3 volte) per 30 minuti, quindi (3 volte) per 1 ora con 1 ml di PBS a 37 °C.</li>
	<li>Lavare i gel in 2 mL di PBS a RT durante la notte o a 4 °C durante il fine settimana.</li>
</ol>
6. Reazione a catena di ibridazione (HCR) con forcine fluorescenti (Giorno 5)
NOTA: Per il principio HCR, vedi reference22.
<ol>
	<li>Incubare i gel in 500 μL di tampone di amplificazione (amp) per 30 minuti a RT.</li>
	<li>Riscaldare le forcine fluorescenti a 95°C per 90 secondi in una macchina PCR e raffreddarle rapidamente a 25°C per 30 minuti.</li>
	<li>Per ogni sonda, diluire le coppie di forcine corrispondenti (h1 e h2) 1:50 in tampone amp, preparando 300 μl per gel e vortice.</li>
	<li>Incubare i gel con la miscela di forcine per 3 ore a RT al buio.</li>
	<li>Lavare i gel (2x) per 15 min con 750 μL di 5x SSCT e (2x) per 30 min con 1 mL di 0,5x SSCT a RT.</li>
	<li>Se il cervello esprime GFP, colorare con 500 μL di anticorpo anti-GFP-AF488 (1:500) in PBT (0,1%) contenente 5 mg/mL di BSA ultrapura e incubare durante la notte (o durante il fine settimana) a 4 °C.</li>
</ol>
7. Montaggio dei gel e imaging (Giorno 6)
<ol>
	<li>Dopo l'incubazione degli anticorpi, sciacquare i gel una volta e lavare (1 volta) per 30 minuti con 1 ml di PBT (0,1%), seguito da (3 volte) per 30 minuti con 1 ml di PBS. 
	NOTA: Il lavaggio in PBS comporterà un'espansione 2x; per un'espansione 3x, lavare con SSC 0,05x.</li>
	<li>Durante il lavaggio, rivestire due volte la superficie di fissaggio del gel del supporto per gel del microscopio a foglio luminoso con 1 μL di polilisina, lasciandolo asciugare a 37 °C tra una mano e l'altra. Allo stesso modo, per l'imaging confocale, rivestire l'area di attacco del gel di un piatto con fondo di vetro con applicazioni ripetute di polilisina.</li>
	<li>Colorare i gel per 30 minuti a RT in 1 mL di 5 μg/mL DAPI/PBS o DAPI/0,05x SSC o, in alternativa, colorare per una notte a 4 °C.</li>
	<li>Per montare il gel sul supporto per gel (microscopio a foglio luminoso) o sul piatto con fondo in vetro (microscopio confocale), posizionare il gel su un vetrino coprioggetti e asciugare accuratamente i bordi con un panno privo di lanugine. Assicurarsi che il gel sia orientato in modo che il tessuto sia il più vicino all'obiettivo. Usando un pennello, posizionare delicatamente il gel sulla superficie della polilisina con un solo movimento. Per l'imaging, immergere il gel in PBS (o 0,05x SSC se si espande a 3x). 
	NOTA: Dopo l'imaging, i gel possono essere rimossi delicatamente dalla superficie della polilisina con un pennello umido e trasferiti in una provetta da microcentrifuga da 2 mL.</li>
	<li>Per un nuovo sondaggio immediato, procedere al giorno 7. Per la conservazione a lungo termine (da 1 settimana a 6 mesi), conservare i gel in 1 mL di 5x SSC a 4 °C. Quando è pronto per l'uso, lavare i gel (3 volte) per 10 minuti con 1 ml di PBS prima di procedere. 
	NOTA: L'entità dell'espansione è generalmente coerente nei buffer descritti (~2x in PBS e ~3x in 0,05x SSC). Per controllare il fattore di espansione, misurare le dimensioni di un cervello prima e dopo l'espansione nelle immagini scattate con uno stereomicroscopio a fluorescenza. Per visualizzare il cervello dopo l'espansione, coloralo brevemente con DAPI. Il fattore di espansione approssimativo è la dimensione post-espansione divisa per la dimensione pre-espansione.</li>
</ol>
8. Sonde di stripping e forcine per il multiplexing (Giorno 7)
<ol>
	<li>Incubare i gel per 30 minuti in 1 mL di tampone DNase1 a 37°C.</li>
	<li>Aggiungere 50 μl di DNase1 a 450 μl di tampone DNasi. Mescolare delicatamente, ma non vortice. Incubare i gel in 500 μL di DNase1 per 2 ore a 37 °C.</li>
	<li>Lavare (4 volte) per 15 minuti con 1 mL di PBS a RT. I gel sono ora pronti per il prossimo ciclo di ibridazione (Giorno 3, fase 6).</li>
</ol>

<ol><li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+method+for+mapping+genes+on+phila+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Immunological method for mapping genes on phila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li>
<li>Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+in+situ+hybridization+-+A+personal+history%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The origin of in situ hybridization - A personal history.</a> Methods. 98, 4-9 (2016).</li>
<li>Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization%3A+Quantitative+imaging+of+single+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules.</a> BMB Rep. 46 (2), 65-72 (2013).</li>
<li>Long, X., Colonell, J., Wong, A. M., Singer, R. H., Lionnet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mRNA+imaging+throughout+the+entire+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative mRNA imaging throughout the entire Drosophila brain.</a> Nat Methods. 14 (7), 703-706 (2017).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+for+quantitating+post-transcriptional+regulation+in+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence in situ hybridization for quantitating post-transcriptional regulation in Drosophila brains.</a> Methods. 126, 166-176 (2017).</li>
<li>Meissner, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+neurotransmitter+identity+in+the+whole-mount+Drosophila+brain+using+multiplex+high-throughput+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping neurotransmitter identity in the whole-mount Drosophila brain using multiplex high-throughput fluorescence in situ hybridization.</a> Genetics. 211 (2), 473-482 (2019).</li>
<li>Duckhorn, C. J., Junker, I. P., Ding, Y., Shirangi, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+in+situ+hybridization+chain+reaction+and+immunostaining+to+visualize+gene+expression+in+whole-mount+Drosophila+central+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Combined in situ hybridization chain reaction and immunostaining to visualize gene expression in whole-mount Drosophila central nervous systems.</a> Behavioral Neurogenetics. 181, 1-14 (2022).</li>
<li>Eng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-scale+super-resolved+imaging+in+tissues+by+RNA+seqFISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH.</a> Nature. 568 (7751), 235-239 (2019).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+cell+atlas+of+the+mouse+primary+motor+cortex+by+MERFISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved cell atlas of the mouse primary motor cortex by MERFISH.</a> Nature. 598 (7879), 137-143 (2021).</li>
<li>Janssens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+in+adult+Drosophila+reveals+new+cell+types+in+the+brain+and+identifies+subcellular+mRNA+patterns+in+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics in adult Drosophila reveals new cell types in the brain and identifies subcellular mRNA patterns in muscles.</a> eLife. 13, RP92618(2024).</li>
<li>Gandin, V., et al. Deep-tissue spatial omics: Imaging whole-embryo transcriptomics and subcellular structures at high spatial resolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGandin%2C+V+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+single-cell+transcriptome+imaging+of+thick+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional single-cell transcriptome imaging of thick tissues.</a> eLife. 12, RP90029(2023).</li>
<li>Moses, L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Museum+of+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Museum of spatial transcriptomics.</a> Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging%3A+Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical imaging: Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nat Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li>
<li>Schwarzkopf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization+chain+reaction+enables+a+unified+approach+to+multiplexed%2C+quantitative%2C+high-resolution+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Development. 148 (22), 199847(2021).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EASI-FISH+for+thick+tissue+defines+lateral+hypothalamus+spatio-molecular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EASI-FISH for thick tissue defines lateral hypothalamus spatio-molecular organization.</a> Cell. 184, 6361-6377 (2021).</li>
<li>Eddison, M., Ihrke, G. Expansion-assisted iterative fluorescence in situ hybridization (EASI-FISH) in Drosophila CNS. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEddison%2C+M+%22protocols.io%22">protocols.io</a>. , (2022).</li>
<li>Meissner, G., et al. A split-GAL4 driver line resource for Drosophila CNS cell types. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeissner%2C+G+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Nern, A., et al. Connectome-driven neural inventory of a complete visual system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNern%2C+A+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>FlyLight Protocol. , HHMI Janelia Research Campus. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols">https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols</a> (2025).</li>
<li>HCR Amplification Technology. , HCR. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.molecularinstruments.com/technology">https://www.molecularinstruments.com/technology</a> (2025).</li>
<li>Wolff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+driver+lines+targeting+the+Drosophila+central+complex+and+their+use+to+investigate+neuropeptide+expression+and+sleep+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific driver lines targeting the Drosophila central complex and their use to investigate neuropeptide expression and sleep regulation.</a> eLife. 14, RP104764(2025).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Watanabe, K., Chiu, H., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+in+situ+mapping+of+neuronal+activation+in+Drosophila+during+social+behaviors+and+optogenetic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Whole-brain in situ mapping of neuronal activation in Drosophila during social behaviors and optogenetic stimulation.</a> eLife. 12, RP92380(2024).</li>
<li>Damstra, H. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cellular+and+tissue+ultrastructure+using+Ten-fold+Robust+Expansion+Microscopy+%28TREx%29%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx).</a> eLife. 11, e73775(2022).</li>
<li>Xu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+state+coding+by+molecularly+defined+paraventricular+hypothalamic+cell+type+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Behavioral state coding by molecularly defined paraventricular hypothalamic cell type ensembles.</a> Science. 370 (6514), abb2494(2020).</li>
<li>Wang, Y., et al. EASI-FISH for thick tissue defines lateral hypothalamus spatio-molecular organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+Y+%22GitHub%22">GitHub</a>. , (2021).</li>
<li>Park, G., et al. Using Amira to generate cell body masks in fluorescent light sheet microscopy images of EASI-FISH samples. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPark%2C+G+%22protocols.io%22">protocols.io</a>. , (2023).</li>
<li>Bahry, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RS-FISH%3A+Precise%2C+interactive%2C+fast%2C+and+scalable+FISH+spot+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">RS-FISH: Precise, interactive, fast, and scalable FISH spot detection.</a> Nat Methods. 19 (12), 1563-1567 (2022).</li>
<li>Managan, C., Ihrke, G. EASI-FISH spot counting in Drosophila brain using RS-FISH. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManagan%2C+C+%22protocols.io%22">protocols.io</a>. , (2024).</li>
</ol>

Non è stato dichiarato alcun conflitto di interessi.

Il protocollo EASI-FISH descritto per il sistema nervoso intatto di Drosophila consente il rilevamento di dozzine di trascritti nello stesso cervello o SNC. È robusto, semplice e sensibile e può essere combinato con il rilevamento GFP per identificare sottogruppi di neuroni o glia. Poiché questo metodo è facile da implementare, dovrebbe facilitare la ricerca da parte dei laboratori di Drosophila interessati alla mappatura e alla quantificazione dell'espressione genica nel cervello intatto del moscerino....

FISH è stato utilizzato per la prima volta in Drosophila oltre 40 anni fa per mappare i geni sui cromosomi politene1,2. Oggi, la FISH a singola molecola è il gold standard per la localizzazione e la quantificazione spazialmente dei trascritti di mRNA in tessuti intatti3. Tuttavia, a causa di problemi di integrità del campione e perdita di RNA, le tecniche di FISH a singola molecola a montatura intera in Drosophila sono state limitate a pochi geni che possono essere analizzati nello stesso campione4,5,6,7. Mentre il recente sviluppo dei codici a barre (ad esempio8,9,10) aumenta il numero di trascrizioni che possono essere rilevate fino a diverse centinaia anche in tessuti spessi11,12, la creazione di tali protocolli richiede un notevole investimento di risorse, che potrebbe essere un ostacolo all'implementazione. In effetti, molte tecniche inventive di trascrittomica spaziale non si sono mai diffuse oltre le loro istituzioni di origine13. Pertanto, un metodo semplice e relativamente poco costoso per rilevare l'espressione di dozzine di geni nello stesso cervello intatto faciliterebbe vari obiettivi di ricerca: convalida dei dati del seq dell'RNA e dell'atlante cellulare, mappatura dei tipi di cellule molecolari in tutto il SNC, quantificazione delle differenze specifiche dello sviluppo, del sesso o della specie nell'espressione genica o misurazione dei cambiamenti nell'espressione genica indotti dalla grande varietà di perturbazioni genetiche o ambientali disponibili in Drosophila. 
La microscopia ad espansione è una tecnica che consente ai ricercatori di osservare i tessuti a una risoluzione più elevata espandendoli in un idrogel gonfiabile14. EASI-FISH combina la microscopia ad espansione e l'RNA FISH15, che utilizza la reazione a catena di ibridazione (HCR), una tecnica non enzimatica per rilevare il legame della sonda oligo16. EASI-FISH è stato sviluppato per la prima volta come approccio alternativo alla FISH su tessuto sottile per mappare i modelli di espressione di dozzine di geni in fette di tessuto spesse (300 μm) di ipotalamo laterale di topo17. Questo metodo è ideale per l'applicazione al cervello di mosca adulta, dato che questo tessuto ha uno spessore inferiore a 300 μm e un prototipo di protocollo EASI-FISH per mosche è stato recentemente descritto18. Qui, i cervelli di Drosophila sezionati e fissati sono incorporati in un idrogel rigonfiabile, dove l'mRNA e le proteine sono ancorati covalentemente al polimero del gel con gli agenti alchilanti Melphalan-X e Acryloyl-X (Ac-X), rispettivamente. Dopo la digestione delle proteine, che consente l'espansione isotropa del cervello, le sonde oligo di DNA gene-specifiche vengono ibridate con l'mRNA nel tessuto per localizzare i trascritti di interesse. Le forcine di DNA marcate in fluorescenza vengono quindi aggiunte in una seconda fase di ibridazione. Più molecole di forcina polimerizzano nella reazione HCR per formare polimeri di DNA metastabili. Ciò porta a un'amplificazione del segnale per i singoli trascritti, che possono essere rilevati come punti luminosi mediante foglio luminoso o microscopia confocale.
L'ancoraggio covalente dell'mRNA e della proteina alla matrice del gel e la digestione proteolitica delle proteine dopo la formazione del gel creano un ambiente in cui i trascritti dell'mRNA sono relativamente stabili e potenzialmente più accessibili per il legame della sonda. La stabilità dell'mRNA e del gel consente cicli multipli di risondaggio e imaging, con lo stripping delle sonde di DNA e del prodotto HCR mediante incubazione con l'enzima DNase1 tra i cicli15,17. Inoltre, l'espansione del campione riduce l'autofluorescenza e la diffusione della luce mediante de-affollamento molecolare e aumenta efficacemente la risoluzione dell'immagine14. Pertanto, i singoli trascritti di mRNA possono essere risolti più facilmente.
GFP sostiene la procedura in modo sufficiente a rimanere rilevabile mediante fluorescenza o legame anticorpale post-espansione. Pertanto, questo reporter può essere utilizzato per contrassegnare e segmentare i tipi di celle di interesse. In combinazione con le numerose linee di driver split-GAL4 specifiche per i neuroni disponibili (ad esempio, 19,20), questo apre la possibilità di ottenere ulteriori informazioni sull'identità molecolare di un tipo neuronale o di identificare sottotipi molecolari che non possono essere facilmente distinti dalla loro anatomia.
Qui viene descritta una versione aggiornata del prototipo del protocollo EASI-FISH18 che presenta un'eccellente ritenzione dell'mRNA, la rimozione delle difficoltà tecniche e una maggiore robustezza del gel. Le modifiche includono l'aumento della concentrazione di PFA, l'abbassamento della temperatura di fissazione e la facilitazione della preparazione del campione montando il cervello prima dell'incubazione con Melphalan-X e Ac-X. Questo protocollo incorpora anche una nuova ricetta di gel per aumentare la robustezza del gel, che riduce efficacemente i danni al gel durante l'esecuzione di molti cicli di FISH e imaging. Queste modifiche rendono il protocollo più semplice da eseguire, riducendo sia il tempo di elaborazione che l'uso dei reagenti e aumentando la fiducia in risultati coerenti. È importante sottolineare che la capacità di multiplexing è aumentata in modo tale che dozzine di geni possano essere studiati nello stesso cervello per un periodo di mesi. Ciò è illustrato dai modelli di espressione di diversi geni neuronali nel cervello adulto di Drosophila in una gamma di livelli di espressione.

<table><tbody><tr><td>Provette per PCR da 0,2 mL</td><td>Stati Uniti Scientifici&nbsp;</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga con tappo a vite da 0,5 mL, Amber</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1405-9707</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, PH 8, privo di RNasi</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>10M NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP 3994</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>ThermoFisher</td><td>AM 9763</td><td></td></tr><tr><td>40% acrilammide&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>4-idrossi-TEMPO (4HT)</td><td>Sigma</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl RNasi-free&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>AM97060G</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipetta di trasferimento - Punta fine</td><td>Global Scientific&nbsp;</td><td>134070-S20</td><td></td></tr><tr><td>Piastra inferiore in vetro a 6 pozzetti&nbsp;</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, anidro&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>042311-K7</td><td></td></tr><tr><td>Acido acrilico</td><td>TCI</td><td>A0141</td><td></td></tr><tr><td>Acriloil-X&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A20770</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio (APS)</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di amplificazione&nbsp;</td><td>Strumenti molecolari</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>DMSO anidro</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>AstA_B2</td><td>Strumenti molecolari</td><td>PRR477</td><td></td></tr><tr><td>ChAT_B1</td><td>Strumenti molecolari</td><td>PRG115</td><td></td></tr><tr><td>Crz_B5</td><td>Strumenti molecolari</td><td>PRR480</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>Open source</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr> <tr><td>FMRFa_B2</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRR487</td><td></td></tr><tr><td>GAD1_B5</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTE581</td><td></td></tr><tr><td>GFP Anticorpo policlonale, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21311</td><td></td></tr><tr>Strumenti <td>molecolari</td><td></td> <td>tampone di ibridazione</td><td></td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</tr><tr><td>Imaris Stitcher</td><td>Oxford Instruments</td><td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher</td><td></td></tr><tr><td>visualizzatore Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer</td><td></td></tr><tr><td>JF-669, SE&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>6420</td><td></td></tr><tr><td>Melfalan</td><td>Caymen Chemicals</td><td>16665</td><td></td></tr><tr><td>MOP Buffer</td><td>Fisher</td><td>BP308-100</td><td></td></tr><tr><td>N,N Metilene-bis-acrilammide&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina (TEMED)</td><td>Sigma</td><td>T22500</td><td></td></tr><tr><td>Acqua senza nucleasi&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Sonde Oligo&nbsp;</td><td>Strumenti molecolari</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>BP24384</tr><tr><td>Photoflo-200&nbsp;</td><td>EMS</td><td>74257</td><td></td></tr><tr><td>Bromidrato di poli-L-lisina (polilisina)</td><td>Sigma</td><td>P1524</td><td></td></tr> Strumenti <tr><td>molecolari</td> per<td>tampone di lavaggio della sonda</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>proteinasi K&nbsp;</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Kit di rimozione rapida dei nucleotidi</td><td>Qiagen</td><td>28306</td><td></td></tr><tr><td>RNasi Via&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>7003, reagente</td><td></td>di decontaminazione</tr><tr><td>senza RNasi DNase1</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>S2</td><td>Medium ThermoFisher</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizioni in silicone&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P24743</td><td></td></tr><tr><td>Tdc2_B5</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTE880</td><td></td></tr><tr><td>Tk_B5</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRR484</td><td></td></tr><tr><td>UltaPure 10% SDS</td><td>Thermofisher</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure BSA</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2616</td><td></td></tr><tr><td>Forcine non coniugate e coniugate al fluoro Alexa</td><td>Strumenti molecolari</td><td></td><td></td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</tr><tr><td>VAChT_B1</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTA904</td><td></td></tr><tr><td>vGLUT_B2</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTB212</td><td></td></tr><tr><td>Zeis Z7 Gel Holder&nbsp;</td><td>Janelia&nbsp;</td><td>File CAD disponibili su richiesta</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale confocale Zeiss LSM 980</td><td>Zeiss</td><td>https://www.janelia.org/node/46947/#lsm980</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Z7 Microscopio a foglio leggero</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento multiplex dell'espressione genica nel cervello intatto di drosophila mediante ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Comprendere l'espressione genica è essenziale per decifrare le funzioni cellulari. Tuttavia, i metodi per analizzare l'espressione di numerosi geni in situ all'interno di un dato tessuto rimangono limitati. Il protocollo EASI-FISH qui descritto è stato adattato per rilevare l'espressione di dozzine di geni nel sistema nervoso centrale (SNC) adulto di Drosophila intatto utilizzando reagenti disponibili in commercio. Questo protocollo include una nuova formulazione in gel che migliora la robustezza del gel, consentendo più cicli di ibridazione e consentendo l'incorporazione di più cervelli per gel. Questo miglioramento aumenta la produttività, facilita il confronto ottimale delle condizioni sperimentali e riduce i costi dei reagenti. Inoltre, utilizzando il sistema GAL4-UAS per la co-rilevazione della proteina fluorescente verde (GFP), l'espressione genica può essere visualizzata in specifici tipi di cellule neuronali o gliali. In particolare, l'alta risoluzione ottenuta attraverso la microscopia ad espansione, combinata con la sensibilità del metodo, consente la rilevazione di singoli trascritti di RNA. Questo approccio integra efficacemente un'elevata qualità dell'immagine con un'elevata produttività, rendendolo un potente strumento per studiare l'espressione genica in tutto il cervello di mosca intatto.

Le prestazioni di questo protocollo EASI-FISH modificato sono dimostrate rilevando l'espressione di diversi geni associati a neurotrasmettitori e neuropeptidi nel cervello adulto di Drosophila attraverso più cicli. Tipicamente, i cervelli gelificati ed espansi sono stati ibridati con due o tre sonde per ogni ciclo, seguiti da HCR con coppie di hairpin coniugate con Alexa Fluor (AF) 488 (a meno che non fosse espressa GFP), AF546 e AF647 o Janelia Fluor (JF) 669. L'acquisizione delle immagini è stata effettuata pr...

L'ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione (EASI-FISH) è una tecnica robusta che combina la microscopia ad espansione con l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) per rilevare l'espressione di più geni nei tessuti spessi. Questo protocollo delinea i recenti progressi nel metodo e il suo adattamento per l'etichettatura del sistema nervoso centrale della Drosophila intatta.

Rilevamento multiplex dell'espressione genica nel cervello intatto di Drosophila mediante ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

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Doppia fluorescenza In situ</emIbridazione> nelle sezioni cervello fresco

Questo video mostra la colorazione in immunofluorescenza di un cervello di Drosophila transgenico per l'imaging di cellule gliali su singola cellula. Il cervello esprime proteine mirate alla membrana fuse con diverse combinazioni di epitopi antigenici sotto il controllo di un sistema ricombinasi gliale-specifico. I cervelli isolati e fissati vengono colorati con anticorpi primari specifici per gli epitopi antigenici, seguiti da anticorpi secondari coniugati con fluorofori. Questa etichettatura...

Colorazione in immunofluorescenza del cervello di Drosophila per l'imaging di cellule gliali a singola cellula

Fonte: Jolly, S., et.al. Combinazione di ibridazione a doppia fluorescenza  in situ con immunomarcatura per il rilevamento dell'espressione di tre geni in sezioni cerebrali di topo. J. Vis. Exp. (2016). Questo video dimostra l'uso dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per visualizzare l'espressione di due bersagli di RNA in sezioni cerebrali di topo. Il protocollo prevede il rilevamento sequenziale dell'RNA utilizzando sonde marcate con isotiocianato di fluoresceina e digossigenina,...

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Tutta la Monte RNA fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; L&#39;ibridazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

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Multi-bersaglio Cromogenico Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione per il confronto Gene domini di espressione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

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La combinazione di doppio Fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni

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Spinal Cord Elettrofisiologia II: extracellulare fabbricazione di elettrodi di aspirazione

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Rilevamento multiplex dellespressione genica nel cervello intatto di Drosophila mediante ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione (Video) | JoVE Journal

Rilevamento multiplex dell'espressione genica nel cervello intatto di Drosophila mediante ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione

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