Name: Analisi della stabilità dei plasmidi con microfluidica a goccioline open-source (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Impara a analizzare la ritenzione dei plasmidi nei batteri utilizzando microfluidica a goccioline open-source e microscopia a fluorescenza. Questo metodo offre un'analisi ad alto throughput di microcolonie cellulari singole con maggiore specificità rispetto alle tecniche tradizionali.

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<ol><li>Wein, T., Hülter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+plasmid+stability+under+non-selective+conditions+maintains+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Emergence of plasmid stability under non-selective conditions maintains antibiotic resistance.</a> Nat Commun. 10 (1), 2595(2019).</li>
<li>Rodríguez-Beltrán, J., DelaFuente, J., León-Sampedro, R., MacLean, R. C., Millán, ÁS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+horizontal+gene+transfer%3A+The+role+of+plasmids+in+bacterial+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beyond horizontal gene transfer: The role of plasmids in bacterial evolution.</a> Nat Rev Microbiol. 19 (6), 347(2021).</li>
<li>Wein, T., Dagan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmid evolution.</a> Curr Biol. 30 (19), R1158-R1163 (2020).</li>
<li>Chen, S., Larsson, M., Robinson, R. C., Chen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+convenient+measurement+of+plasmid+stability+in+lab+and+clinical+isolates+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct and convenient measurement of plasmid stability in lab and clinical isolates of E. coli.</a> Sci Rep. 7 (1), 4788(2017).</li>
<li>Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmid+system+with+tunable+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A plasmid system with tunable copy number.</a> Nat Commun. 13 (1), 3908(2022).</li>
<li>Silva, F., Queiroz, J. A., Domingues, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+metabolic+stress+and+plasmid+stability+in+plasmid+DNA+production+by+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Evaluating metabolic stress and plasmid stability in plasmid DNA production by Escherichia coli.</a> Biotechnol Adv. 30 (3), 691-708 (2012).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+novel+pJRD215-derived+plasmids+using+chloramphenicol+acetyltransferase+%28cat%29+gene+as+a+selection+marker+for+Acidithiobacillus+caldus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Construction of novel pJRD215-derived plasmids using chloramphenicol acetyltransferase (cat) gene as a selection marker for Acidithiobacillus caldus.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0183307(2017).</li>
<li>Moragues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Droplet-based microfluidics.</a> Nat Rev Methods Primers. 3 (1), 32(2023).</li>
<li>Vitalis, C., Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+interactions+in+microfluidic+droplets+for+enhanced+biotechnology+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Leveraging interactions in microfluidic droplets for enhanced biotechnology screens.</a> Current Opinion in Biotechnology. 82, 102966(2023).</li>
<li>Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F., Soennichsen, M., Tel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipette-tip+based+method+for+seeding+cells+to+droplet+microfluidic+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A pipette-tip based method for seeding cells to droplet microfluidic platforms.</a> J Vis Exp. (144), e57848(2019).</li>
<li>Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+hardware%3A+From+DIY+trend+to+global+transformation+in+access+to+laboratory+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">Open hardware: From DIY trend to global transformation in access to laboratory equipment.</a> PLOS Biol. 21 (1), e3001931(2023).</li>
<li>Murillo, L. F. R., Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Welcome+to+the+journal+of+open+hardware%5BTitle%5D)+AND+%22J+Open+Hardware%22%5BJournal%5D)">Welcome to the journal of open hardware.</a> J Open Hardware. 1 (1), (2017).</li>
<li>Shin, J. H., Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+and+do-it-yourself+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Open-source and do-it-yourself microfluidics.</a> Sens Actuators B Chem. 347, 130624(2021).</li>
<li>Pryszlak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+gut+microbiome+strains+for+cultivation-free+genome+sequencing+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">Enrichment of gut microbiome strains for cultivation-free genome sequencing using droplet microfluidics.</a> Cell Rep Methods. 2 (1), 100137(2021).</li>
<li>Pollak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+loop+assembly%3A+open%2C+efficient+and+cross-kingdom+DNA+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Universal loop assembly: open, efficient and cross-kingdom DNA fabrication.</a> Biology. 5 (1), (2020).</li>
<li>Volkmer, B., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition-dependent+cell+volume+and+concentration+of+Escherichia+coli+to+facilitate+data+conversion+for+systems+biology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Condition-dependent cell volume and concentration of Escherichia coli to facilitate data conversion for systems biology modeling.</a> PLoS ONE. 6 (7), e23126(2011).</li>
<li>Li, H., et al. Squid: Simplifying quantitative imaging platform development and deployment. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+H+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2020).</li>
<li>Abate, A. R., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+multiple+emulsification+with+drop+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Faster multiple emulsification with drop splitting.</a> Lab Chip. 11 (11), 1911-1915 (2011).</li>
<li>Lau, B. T. C., Malkus, P., Paulsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+quantitative+methods+for+measuring+plasmid+loss+rates+reveal+unexpected+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">New quantitative methods for measuring plasmid loss rates reveal unexpected stability.</a> Plasmid. 70 (3), 353-361 (2013).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-ottanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533-25G</td><td>Per rompere l'emulsione</td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td></td><td></td><td>Per la permeabilizzazione cellulare</td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Winkler</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia 0,75</td><td></td><td></td><td>mm e 1,8 mm</td></tr><tr><td>Transilluminatore LED blu</td><td>IO Rodeo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo di coltura</td><td></td><td></td><td></td>Essiccatore</tr><tr><td></td><td></td><td></td> da 15 mL <td>con pompa a vuoto</td></tr><tr><td>Tazza</td><td></td><td></td> monouso <td>per la miscelazione di PDMS</td></tr><tr><td>Forchetta</td><td></td><td></td> monouso <td>Per la miscelazione</td></tr> di <tr><td>PDMS E. coli ceppo</td><td></td><td></td><td></td>TOP10</tr><tr><td>Microscopio FluoPi</td><td>https://github.com/wenzel-lab/FluoPi</td><td></td><td>Sistema di imaging a fluorescenza verde per l'analisi di piastre</td></tr><tr><td>Olio fluorurato</td><td>3M</td><td></td><td>Novec 7500</td></tr><tr><td>Riscaldatore per vetrini</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring</td><td></td><td>Per il controllo della temperatura a 40 gradi C di chip microfluidico</td></tr><tr><td>Vetrini Piastra riscaldante</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Meccanica</td><td></td><td>Per evaporazione Aquapel</td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini</td><td>Fiji/ImageJ</td><td></td><td>2.14.0/1.54f</td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Mundo Lab</td><td></td><td>MLAB Scientific / Per l'incubazione di piastre e microgel&nbsp;</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td></td><td></td><td>Per la pulizia di vetrini</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td></td><td></td><td>100 ug/mL di concentrazione</td></tr><tr><td>Spalmatore</td><td></td><td></td> a forma di L <td>Per la diffusione di batteri su piastre di agar</td></tr><tr><td>Stampo</td><td></td><td></td> master <td>Design del chip su wafer di silicone o vetro</td></tr><tr><td>Microprovette</td><td></td><td></td><td>2 mL</td></tr><tr><td>di soluzione</td><td></td><td></td> di NaCl <td>Sodio cloruro 0,9% p/v</td></tr><tr><td>Stadio di microscopia stroboscopico hardware open source</td><td>https://github.com/wenzel-lab/flow-microscopy-platform</td><td></td><td>Per microscopia a campo chiaro</td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Citotest</td><td>2303-1090</td><td>90 x 15 mm</td></tr><tr><td>Riscaldatore per puntali per pipette</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring</td><td></td><td>Per il controllo della temperatura a 40 gradi C di punta per pipetta</td></tr><tr><td>Pulitore al plasma</td><td>Diener Electronic</td><td>117056</td><td>Per l'incollaggio di PDMS con un vetrino in vetro</td></tr><tr><td>pCA_Odd1</td><td></td><td></td> plasmidico <td>Codifica per la resistenza a sfGFP e kanamicina</td></tr><tr><td>Tubi in politetrafluoroetilene (PTFE) Adtech</td><td>Polymer Engineering Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Premiscelato Luria Bertoni medium</td><td>US Biological Life Science</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Propidio ioduro (PI)</td><td></td><td></td><td>Per la colorazione del</td></tr><tr><td>sistema di regolazione della pressione e del flusso basato su Raspberry Pi</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller</td><td></td><td>Per il controllo di pressione e portate</td></tr><tr><td>Base in elastomero siliconico</td><td>Kit Sylgard</td><td></td><td>PDMS - 184 Kit elastomero siliconico</td></tr><tr><td>Agente indurente in elastomero siliconico</td><td>Kit Sylgard</td><td></td><td>PDMS - 184 Kit elastomero siliconico</td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td></td><td></td><td>per misurare l'assorbanza</td></tr><tr><td>Microscopio SQUID</td><td>https://github.com/wenzel-lab/SQUID-bioimaging-platform</td><td></td><td>Sistema di imaging multifluorescenza per l'analisi delle cellule colorate</td></tr><tr><td>Anello</td><td></td><td></td> sterile <td>Per il prelievo di una colonia e la placcatura delle striature</td></tr><tr><td>Sfera di tensioattivo</td><td>Fluidica</td><td></td><td>Pico-Surf</td></tr><tr><td>Siringhe</td><td>NIPRO</td><td></td><td>Con filtri e tubi</td></tr><tr><td>Agitatore a temperatura controllata</td><td>Mundo Lab</td><td></td><td>DLAB HCM100-Pro</td></tr><tr><td>Pinzetta</td><td></td><td></td><td></td></tr> a <tr><td>bassissima temperatura di gelificazione agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576-5G</td><td>Per la generazione di perle di idrogel Soluzione</td></tr><tr><td>idrorepellente (fluoroalchilsilano)</td><td>Aquapel</td><td></td><td>Per il trattamento microcanali del dispositivo PDMS</td></tr></tbody></table>

analisi della stabilità dei plasmidi con microfluidica a goccioline open-source

Plasmid Stability Analysis with Open-Source Droplet Microfluidics

Validazione dell'incapsulamento cellulare e della formazione di microcolonie
L'incapsulamento cellulare può essere confermato visivamente eseguendo la microscopia in campo chiaro sulle microgoccioline di gel prima di rompere l'emulsione e lavare i microgel. Un risultato rappresentativo dell'emulsione in questa fase è mostrato nella Figura 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig4.jpg"> 
Figura 4: Sezione di un'immagine di sovrapposizione al microscopio a fluorescenza. Dopo l'incubazione notturna, microcolonie rappresentative di sfGFP esprimono colonie di E. coli all'interno di microgoccioline di gel. È stato utilizzato un obiettivo da microscopio con ingrandimento 10x e 0,30 NA. Barra della scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Risultati dell'analisi delle immagini
Una volta che i microgel sono colorati e in campo chiaro, così come i canali di fluorescenza acquisiti in diverse posizioni, è possibile visualizzare le colonie identificate come negative nelle immagini originali (vedi Figura 5A). I dati estratti da tutte le immagini di un esperimento possono essere tracciati per mostrare il rapporto di fluorescenza di varie colonie, evidenziando quelle che hanno perso la fluorescenza codificata dai plasmidi (vedi Figura 5B). I risultati indicano che 100 colonie hanno perso la loro funzionalità plasmidica o plasmidica su un totale di 2785 microcolonie analizzate, corrispondenti al 3,6%.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig5.jpg"> 
Figura 5: Quantificazione delle microcolonie negative. (A) Sezione di un'immagine di sovrapposizione al microscopio a fluorescenza. Dopo la rimozione dell'olio e la colorazione, colonie rappresentative in microgel che esprimono sfGFP e due colonie negative hanno mostrato la fluorescenza rossa della colorazione del DNA (cerchiata in nero). Barra della scala: 100 μm. (B) Grafico a dispersione dei valori di fluorescenza di singole microcolonie estratte da 16 immagini di microscopia multicanale. Le colonie senza alcuna fluorescenza verde sono state contate come negative, come indicato in rosso nel grafico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Quantificazione della piastra di agar
Le immagini delle piastre triplicate sono mostrate nella Figura 6, con le colonie non fluorescenti indicate da frecce bianche. La prima lastra (Figura 6A) mostrava un totale di 213 colonie, di cui 1 non fluorescente. La seconda piastra (Figura 6B) aveva un totale di 49 colonie, senza colonie non fluorescenti. La terza lastra (Figura 6C) mostrava un totale di 252 colonie, 6 delle quali non erano fluorescenti. Questi risultati corrispondono a un tasso medio di perdita di plasmidi di colonie del 2,3%, con un'ampia deviazione standard di 3,2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig6.jpg"> 
Figura 6: Identificazione di colonie negative su piastre. (A-C) Colonie di E. coli fluorescenti e non fluorescenti su piastre LB-agar (diametro: 90 mm, altezza: 15 mm). L'inoculo, derivato da E. coli con sfGFP da stock di -80 °C, è stato striato il giorno 1, coltivato con antibiotico il giorno 2 e diluito 1:100 al giorno dal giorno 3 al 6 per consentire la perdita di plasmidi. Le colonie sono state incubate a 37 °C per 24 ore e sottoposte a riprese in una camera FluoPi. Le colonie non fluorescenti sono state potenziate con GIMP e indicate con frecce bianche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Analisi della stabilità dei plasmidi con microfluidica a goccioline open-source

Plasmids play a vital role in synthetic biology by enabling the introduction and expression of foreign genes in various organisms, thereby facilitating ...

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Impara a analizzare la ritenzione dei plasmidi nei batteri utilizzando microfluidica a goccioline open-source e microscopia a fluorescenza. Questo metodo offre un'analisi ad alto throughput di microcolonie cellulari singole con maggiore specificità rispetto alle tecniche tradizionali.

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