Name: Organoidi intestinali suini bidimensionali che riflettono le proprietà fisiologiche dellintestino nativo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Scopri come sviluppare organoidi intestinali suini bidimensionali che replicano le proprietà fisiologiche dell'intestino nativo. Questo modello in vitro sostituisce gli esperimenti animali per studiare i meccanismi di trasporto gastrointestinale.

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Per questo protocollo, due suini sani (maiale pezzato nero di Bentheim; 1 maschio, 1 femmina; 4,5 mesi; circa 65 kg) sono stati sacrificati mediante sparo di bullone in cattività e sanguinamento. Secondo la legge sulla protezione degli animali, questo (macellazione e rimozione di tessuti) non è classificato come esperimento sugli animali, ma deve essere annunciato all'ufficiale del benessere animale (registrazione n. TiHo-T-2023-15) della Fondazione Università di Medicina Veterinaria di Hannover.
1. Rivestimento degli inserti
NOTA: Tutti i passaggi vengono eseguiti con materiali sterili sotto un armadio di sicurezza. Tutte le fasi del protocollo vengono eseguite su ghiaccio se non diversamente specificato.
<ol>
	<li>Scongelare la membrana basale congelata su ghiaccio per almeno 1 ora a temperatura ambiente o per una notte sul ghiaccio a 4 °C. Miscelare la membrana basale 1:40 (v/v) con soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS) ghiacciata in una provetta conica.</li>
	<li>Rimuovere le piastre sterili con inserti dalla confezione. Aggiungere 200 μl di miscela di membrana basale allo scomparto apicale di ciascun inserto.</li>
	<li>Riposizionare il coperchio della piastra a pozzetti e incubare per almeno 1,5 ore a 37 °C, 5% CO2 in un incubatore.</li>
	<li>Aspirare accuratamente la soluzione prima di seminare le cellule. Assicurarsi che la punta non tocchi la membrana durante l'aspirazione.</li>
</ol>
2. Generazione di monostrati di organoidi 2D
NOTA: Gli organoidi del colon suino sono generati e coltivati come descritto per gli organoidi digiunali suini25. Dopo la generazione di organoidi 3D, questi dovrebbero essere coltivati per almeno 3-4 settimane durante il passaggio settimanale per garantire una crescita costante. Il numero di celle all'interno di ciascuna cupola contenenti organoidi 3D, che vengono disciolti nelle fasi successive, è sufficiente a coprire un singolo filtro transmembrana. Prima della generazione del monostrato, gli organoidi 3D sono stati sottoposti a controllo ottico di qualità per verificare la crescita precedente e l'eventuale contaminazione (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67666/67666fig01.jpg"> 
Figura 1: Organoidi 3D rappresentativi. Gli organoidi tridimensionali (A) del digiuno e del colon (B) vengono attentamente esaminati al microscopio prima di generare monostrati. Particolare attenzione è rivolta alla valutazione dei modelli di crescita precedenti, dell'integrità strutturale e della presenza di eventuali impurità o contaminazioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67666/67666fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol>
	<li>Rimuovere il terreno organoidico (Tabella 1) dai pozzetti con organoidi cripta 3D. Aggiungere 1 mL di PBS ghiacciato per pozzetto e sciogliere delicatamente la membrana basale pipettando su e giù con un puntale p1000.</li>
	<li>Raccogliere tutti gli organoidi disciolti in una provetta da 15 mL pre-riempita con 10 mL di PBS ghiacciato. Centrifugare la provetta a 250 x g, 10 min a 4 °C. Aspirare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 1 mL di tripsina/EDTA calda (37 °C) allo 0,05 % (v/v) (in questa fase è possibile raggruppare 2 provette). Incubare per 5 minuti a 37 °C a bagnomaria e successivamente mettere direttamente sul ghiaccio per fermare la reazione.</li>
	<li>Risospendere sul ghiaccio 20 volte con la punta p1000 e altre 15 volte con la punta p1000 + la punta p200 in cima. Aggiungere 10 ml di DMEM ghiacciato integrato con il 10% (v/v) di siero fetale di vitello (FCS).</li>
	<li>Provetta da centrifuga a 1.000 x g, 10 min a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno monostrato (Tabella 1).</li>
	<li>Determinare il numero di cellule viventi per mL utilizzando una camera Neubauer secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>A questo punto, rimuovere la soluzione di rivestimento dallo scomparto apicale e sostituirla con 500 μl di terreno monostrato caldo (37 °C). Aggiungere 3 mL di terreno monostrato nello scomparto basolaterale.</li>
	<li>Determinare la resistenza del bianco (TEER) di ciascun inserto vuoto del pozzetto di trasmissione, come descritto in dettaglio nel passaggio 3. Il tempo in cui non è presente alcun mezzo nella camera apicale dovrebbe essere il più breve possibile per evitare che le cellule si secchino.</li>
	<li>Rimuovere il terreno monostrato apicale e aggiungere per la coltura digiunale 2D 2 x 105 cellule epiteliali e per la coltura 2D del colon 1,5 x 105 cellule epiteliali in 500 μL di terreno monostrato nella camera apicale di ciascun pozzetto.</li>
	<li>Cambiare il mezzo e misurare TEER ogni 2-3 giorni. Misurare TEER prima di cambiare il fluido. Aspirare con cautela il terreno del compartimento apicale e basale e sostituirlo con 500 μL o 3 mL di terreno fresco e caldo (37 °C).<ol>
		<li>Per gli organoidi digiuno: il giorno 16, dopo la semina, passare dal terreno monostrato al terreno di differenziazione (Tabella 1). Per gli organoidi del colon: cambiare il terreno il giorno 7 con il mezzo di differenziazione.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cambiare il mezzo di differenziazione ogni giorno ed eseguire la misurazione TEER durante ogni cambio di fluido. Il giorno 18 (per gli organoidi digiunali) o il giorno 9 (per gli organoidi del colon), dopo la semina, procedere con gli esperimenti funzionali.</li>
</ol>
3. Misura della resistenza elettrica transepiteliale (TEER)
NOTA: Tutte le misurazioni vengono eseguite in una cabina di sicurezza per evitare contaminazioni. Prima di seminare le celle, ogni pozzetto rivestito vuoto viene misurato per ottenere i valori individuali del bianco. Il volt-ohmmetro memorizza i valori su un dispositivo USB introdotto.
<ol>
	<li>Pulire l'elettrodo della bacchetta con etanolo al 70% (v/v) e lasciare asciugare completamente l'elettrodo. Nel frattempo, rimuovere la piastra dall'incubatrice e posizionarla sotto l'armadio.</li>
	<li>Introdurre il braccio corto dell'elettrodo a bacchetta nello scomparto apicale degli inserti e il braccio lungo nello scomparto basolaterale dell'inserto. Evitare il contatto del braccio corto con lo strato cellulare.</li>
	<li>Misurare la resistenza elettrica transepiteliale di ciascun pozzetto transepiteliale. Lasciare che il volt-ohmmetro si equilibri per garantire una misurazione stabile. Misurare i valori TEER facendo clic sul pulsante Memorizza.</li>
	<li>Continuare i passaggi 3.2 e 3.3 con i pozzetti rimanenti. Dopo aver raggiunto l'ultimo pozzo, il volt-ohmmetro apre una richiesta di memorizzazione dei dati su un dispositivo USB. Fai clic su Salva.</li>
	<li>Pulire l'elettrodo dopo ogni piastra e al termine della misurazione e lasciarlo asciugare completamente prima di riporlo.</li>
	<li>Sottrarre i valori in bianco determinati prima della semina delle cellule dai valori cellulari misurati.</li>
</ol>
4. Studi elettrofisiologici di trasporto con la tecnica della camera di Ussing
NOTA: La determinazione degli studi di trasporto elettrofisiologico viene eseguita utilizzando una camera di Ussing costituita da due compartimenti camerali, divisi dall'epitelio. Questa camera è collegata a una pinza di tensione tramite elettrodi Ag/AgCl. Questa tecnica consente di tracciare i processi di trasporto elettrogenico attivo dell'epitelio attraverso le variazioni della corrente di cortocircuito (Isc) indotta dal voltage clamp e della resistenza tissutale (Rt) calcolata dalla legge di Ohm. Isc e Rt vengono registrati ogni 6 s durante l'intero esperimento. Durante l'esperimento, il tessuto studiato viene aerato con carbogeno e incubato con soluzioni modificate di Krebs-Henseleit per garantire condizioni vitali. L'indometacina (10 μM) viene aggiunta alle soluzioni tampone per inibire la sintesi delle prostaglandine26.
<ol>
	<li>Riscaldare le soluzioni tampone mucosale e sieroso a 37 °C e aerare con carbogeno. Assemblare le singole camere utilizzando un inserto vuoto per ogni singola camera. Assicurarsi che i lati apicali dei pozzetti siano tutti rivolti nella stessa direzione.</li>
	<li>Riempire tutte le camere con 5 mL di soluzione tampone per mucosa preriscaldata (Tabella 2). Collegare tutti gli elettrodi della pinza di tensione alle singole camere secondo le istruzioni del produttore. Assicurarsi che non vi siano bolle di gas che interferiscono con gli elettrodi per garantire una misurazione corretta.</li>
	<li>Calibrare il software della camera di Ussing con queste condizioni facendo clic sul pulsante Rf/dpI nel software di bloccaggio della tensione. La resistenza di tutti gli inserti vuoti utilizzati deve essere uguale (~ 70 Ohm) e la corrente deve essere di circa 0 mV (± 5 mV). Se questo non è il caso di alcune camere, verificare il corretto posizionamento degli elettrodi o delle bolle nel sistema.</li>
	<li>Rimuovere tutti gli elettrodi ed eliminare la soluzione tampone usata. Aprire tutte le singole camere e rimuovere gli inserti vuoti. Assicurarsi che l'ordine delle singole camere sia mantenuto.</li>
	<li>Spostare la piastra a pozzetti con gli inserti dall'incubatore all'armadio di sicurezza. Aspirare con cura il terreno basolaterale e apicale.</li>
	<li>Lavare le cellule aggiungendo 500 μL di tampone mucoso caldo (37 °C) alla camera apicale e 3 mL di tampone sieroso alla camera basolaterale. Aspirare i tamponi e ripetere 2 volte.</li>
	<li>Rimuovere gli inserti dalla piastra. Rimuovere delicatamente i supporti degli inserti. Posizionare gli inserti nelle camere di Ussing e assicurarsi che l'orientamento degli inserti sia lo stesso della fase di calibrazione. Assemblare le singole camere come mostrato nella Figura 2.</li>
	<li>Riempire le camere rivolte verso il lato basolaterale delle cellule con 5 mL di tampone sieroso (Tabella 2) e la camera rivolta verso la camera apicale con 5 mL di tampone per mucosa.</li>
	<li>Collegare gli elettrodi e i tubi di aerazione a ogni singola camera. Avviare la misurazione nel software Ussing. Lasciare equilibrare per 15 min.</li>
	<li>Modificare le condizioni da circuito aperto a condizioni di cortocircuito. Equilibrare per 5-10 minuti. Aggiungere 10 μM di forskolina alla camera sierosa. NOTA: L'aggiunta di forskolina può essere sostituita da altri agenti/sostanze a seconda dei singoli segmenti intestinali e delle domande di ricerca.</li>
	<li>Dopo 15 minuti, aggiungere altri agenti allo stesso modo della forskolina o interrompere la misurazione. Rimuovere i tubi di aerazione e gli elettrodi dalle singole camere. Versare le soluzioni tampone di entrambe le camere in una ciotola.</li>
	<li>Smontare le camere e scartare gli inserti o utilizzarli per analisi di follow-up (ad es. immunoistochimica o analisi di espressione)</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67666/67666fig02.jpg"> 
Figura 2: Struttura schematica della camera di Ussing. Vengono mostrate entrambe le camere divise dalla membrana con il monostrato 2D cresciuto. Entrambe le camere sono aerate con carbogeno; La tensione e la corrente sono monitorate da due elettrodi per camera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67666/67666fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
5. Analisi dei dati generati dall'allestimento della camera di Ussing
<ol>
	<li>Importa i dati generati dal software della pinza di tensione in un editor di fogli di calcolo adatto.</li>
	<li>Per determinare i valori basali Isc e Rt , calcolare la media di 10 punti dati consecutivi presi 10 minuti dopo l'inizializzazione delle condizioni di cortocircuito. Ogni singola camera funge da replica tecnica, mentre ogni passaggio di organoidi funge da replica biologica.</li>
	<li>Per valutare gli effetti degli agenti applicati, calcolare la media di 10 punti dati consecutivi immediatamente prima dell'aggiunta dell'agente. Confrontare questa media con il valore massimo (o minimo) osservato dopo l'applicazione dell'agente. I dati ottenuti sono presentati come media ± deviazione standard (SD).</li>
</ol>

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<li>Beduneau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+Caco-2%2FHT29-MTX+co-culture+model+mimicking+variable+permeabilities+of+the+human+intestine+obtained+by+an+original+seeding+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">A tunable Caco-2/HT29-MTX co-culture model mimicking variable permeabilities of the human intestine obtained by an original seeding procedure.</a> Eur J Pharm Biopharm. 87 (2), 290-298 (2014).</li>
<li>Markov, A. G., Veshnyakova, A., Fromm, M., Amasheh, M., Amasheh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+expression+of+claudin+proteins+correlates+with+tight+junction+barrier+properties+in+rat+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+B%22%5BJournal%5D)">Segmental expression of claudin proteins correlates with tight junction barrier properties in rat intestine.</a> J Comp Physiol B. 180 (4), 591-598 (2010).</li>
<li>Pearce, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+tight+junction+composition+and+macromolecular+permeability+among+different+intestinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types.</a> BMC Biology. 16 (1), 19(2018).</li>
<li>Legen, I., Salobir, M., Kerc, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+intestinal+epithelia+as+models+for+absorption+enhancement+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Comparison of different intestinal epithelia as models for absorption enhancement studies.</a> Int J Pharm. 291 (1-2), 183-188 (2005).</li>
<li>Moeser, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+signaling+pathways+activated+by+weaning+mediate+intestinal+dysfunction+in+the+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stress signaling pathways activated by weaning mediate intestinal dysfunction in the pig.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292 (1), G173-G181 (2007).</li>
<li>Moeser, A. J., Ryan, K. A., Nighot, P. K., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+dysfunction+induced+by+early+weaning+is+attenuated+by+delayed+weaning+and+mast+cell+blockade+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal dysfunction induced by early weaning is attenuated by delayed weaning and mast cell blockade in pigs.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (2), G413-G421 (2007).</li>
<li>Seamon, K. B., Padgett, W., Daly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin%3A+unique+diterpene+activator+of+adenylate+cyclase+in+membranes+and+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Forskolin: unique diterpene activator of adenylate cyclase in membranes and in intact cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (6), 3363-3367 (1981).</li>
<li>Herrmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+diversity+of+electrogenic+glucose+transport+characteristics+in+the+small+intestines+of+weaned+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+A+Mol+Integr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Segmental diversity of electrogenic glucose transport characteristics in the small intestines of weaned pigs.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 163 (1), 161-169 (2012).</li>
<li>Wright, E. M., Martin, M. G., Turk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+absorption+in+health+and+disease--sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pract+Res+Clin+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Intestinal absorption in health and disease--sugars.</a> Best Pract Res Clin Gastroenterol. 17 (6), 943-956 (2003).</li>
<li>Crane, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B+-dependent+transport+in+the+intestine+and+other+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Fed+Proc%22%5BJournal%5D)">Na+ -dependent transport in the intestine and other animal tissues.</a> Fed Proc. 24 (5), 1000-1006 (1965).</li>
<li>Inagaki, A., Yamaguchi, S., Ishikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amiloride-sensitive+epithelial+Na%2B+channel+currents+in+surface+cells+of+rat+rectal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Amiloride-sensitive epithelial Na+ channel currents in surface cells of rat rectal colon.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 286 (2), C380-C390 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>piastra a 24 pozzetti</td><td>SARSTEDT AG & Co. KG</td><td>8,33,922</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-10432</td><td>Conservare a -20 &deg;C. Scongelare quando necessario</td></tr><tr><td>accujet S</td><td>Brand GmbH + Co KG, Wertheim, Germania</td><td>26351</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Medium Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>12634010</td><td>Negozio a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Integratore di B27</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>17504044</td><td>Conservare a -20 &deg;C. Scongelare quando necessario</td></tr><tr><td>CaCl2.2 H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germania</td><td>C3306</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>D(+)-Glucosio (wasserfrei)</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germania</td><td>1.08337</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-13027</td><td>Conservare a -20 &deg;C. Scongelare quando necessario</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germania</td><td>M4125</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germania</td><td>154938</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Electrode-Set (AgCl/PtIr/Std.)</td><td>Strumenti scientifici, Simmerath, Germania</td><td>#1316</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus</td><td>Eppendorf SE, Amburgo, Germania</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research</td><td>Eppendorf SE, Amburgo, Germania</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>EVOM3 Manuale epiteliale Volt Ohm Meter</td><td>World precision instruments, Sarasota, USA</td><td>EVM-MT-03-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germania</td><td>F7524</td><td>Conservare a -20 &deg;C. Scongelare quando necessario</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germania</td><td>F6886</td><td>Conservare a -20 &deg;C. Scongelare quando necessario</td></tr><tr><td>gasprofi 1 SCS micro</td><td>WLD-TEC GmbH, Arsenhausen, Germania</td><td>60,04,000</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin 1</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-P1097</td><td>Conservare a -20 &deg;C. Scongelare quando necessario</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>35050061</td><td>Negozio a 4 &deg;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germania</td><td>1090571000</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germania</td><td>H0887</td><td>Conservare a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Herasafe 2025 Classe II Armadio di sicurezza biologica</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>51033316</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore ICO105</td><td>Memmert GmbH + Co.KG, Schwabach, Germania</td><td>62,20,143</td><td></td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germania</td><td>I7378</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germania</td><td>1.04936</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germania</td><td>G7513</td><td>Negozio a -20 &deg;C. Scongelare quando necessario</td></tr><tr><td>LWRN Supernatant</td><td>autoprodotto&nbsp;</td><td></td><td>Conservare a -20 °C. Scongelare quando necessario. L'integratore LWRN è prodotto secondo Miyoshi et al. (2012)</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL</td><td>Corning Incorporated - Life Sciences</td><td>354234</td><td>Store at -20 &deg;C. Scongelare accuratamente sul ghiaccio quando necessario</td></tr><tr><td>Megafuge 1.OR</td><td>Heraeus Instruments, Osterode, Germania</td><td>75003060</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2.6 H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germania</td><td>1.05833</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Na2HPO4.2H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germania</td><td>1.06580</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>N-Acetil-L-cisteina</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germania</td><td>A7250</td><td>Conservare a -20 °C. Scongelare quando necessario</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germania</td><td>1.06404</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germania</td><td>1.06346</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germania</td><td>1.06329</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Neubauer improved chamber</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht, Sondheim vor der Rh&ouml; n, Germania</td><td>40442712</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio convertito Olympus IX70</td><td>Olympus Corporation, Amburgo, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>15140122</td><td>Negozio a -20 &deg;C. Scongelare quando necessario</td></tr><tr><td>PolymyxinB</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germania</td><td>P4932-1MU</td><td>Conservare a -20 &deg;C. Scongelare quando necessario</td></tr><tr><td>Supporto per microscopio Primovert con fototubo binoculare</td><td>Zeiss</td><td>415510-1101-000</td><td></td></tr><tr><td>rm EGF</td><td>Prepotech, New Jersey, USA</td><td>315-09</td><td>Conservare a -20 °C. Scongelare quando necessario</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-10295</td><td>Conservare a -20 °C. Scongelare quando necessario</td></tr><tr><td>Snapwell 3801</td><td>Corning Incorporated - Scienze della vita</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Ussing Base</td><td>System Scientific Instruments, Simmerath, Germania</td><td>#1317</td><td></td></tr><tr><td>Ussing Diffusion Chamber</td><td>Scientific Instruments, Simmerath, Germania</td><td>SKU 1307</td><td></td></tr><tr><td>Pinza di tensione/corrente VCC6</td><td>Scientific Instruments, Simmerath, Germania</td><td>SKU 1310</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-10583</td><td>Conservare a -20 °C. Scongelare quando necessario</td></tr></tbody></table>

organoidi intestinali suini bidimensionali che riflettono le proprietà fisiologiche dell'intestino nativo

Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids Reflecting the Physiological Properties of Native Gut

Questo protocollo facilita la generazione affidabile di monostrati 2D suini disaggregando organoidi 3D derivati dal digiuno e dal colon dei suini. Nell'arco di un periodo di coltivazione di 16 giorni per gli organoidi digiuno e di 9 giorni per gli organoidi del colon, si formano monostrati intatti. Questi monostrati possono essere successivamente utilizzati per valutare le proprietà di trasporto elettrogenico e fisiologico utilizzando la tecnica della camera di Ussing.
Dopo aver disintegrato g...

Organoidi intestinali suini bidimensionali che riflettono le proprietà fisiologiche dell'intestino nativo

The gastrointestinal tract (GIT) serves both in the digestion of food and the uptake of nutrients but also as a protective barrier against pathogens. ...

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Questo protocollo consente la differenziazione delle cellule pluripotenti umane in organoidi intestinali. Il protocollo imita il normale sviluppo umano differenziando le cellule in una popolazione di endoderma definitivo, endoderma dell'intestino posteriore e quindi epitelio intestinale. Ciò rende il protocollo adatto sia per lo studio dello sviluppo intestinale che per le applicazioni di modellizzazione delle malattie.

Generazione di organoidi intestinali derivati da hiPSC per applicazioni di modellizzazione dello sviluppo e delle malattie

Gli organoidi intestinali derivati dalla biopsia e le tecnologie organ-on-a-chips sono combinati in una piattaforma microfisiologica per ricapitolare la funzionalità intestinale specifica della regione.

Combinazione di organoidi umani e tecnologia Organ-on-a-Chip per modellare la funzionalità specifica della regione intestinale

Questo protocollo descrive un modello di enterocolite necrotizzante apicale (NEC) in un piatto che utilizza enteroidi intestinali piccoli con polarità invertita, consentendo l'accesso alla superficie apicale. Forniamo un protocollo di colorazione immunofluorescente per rilevare l'interruzione epiteliale correlata al NEC e un metodo per determinare la vitalità degli enteroidi apicali-out sottoposti al protocollo NEC-in-a-dish.

In vitro Modello enteroide apical-out di enterocolite necrotizzante

Il presente protocollo descrive la creazione di un sistema di organoidi del colon murino per studiare l'attività e il funzionamento delle cellule staminali del colon in un modello knockout di claudina-7.

Coltura tridimensionale di cripte coloniche murine per studiare ex vivo la funzione delle cellule staminali intestinali

Qui, descriviamo un protocollo per la coltura di organoidi intestinali 3D di maiale da cripte epiteliali crioconservate. Descriviamo anche un metodo per stabilire monostrati cellulari derivati da organoidi 3D, consentendo l'accesso al lato apicale delle cellule epiteliali.

Coltura di organoidi intestinali 3D di maialino da cripte epiteliali crioconservate e creazione di monostrati cellulari

Qui, presentiamo un protocollo per generare organoidi intestinali di ratto e utilizzarli in diverse applicazioni a valle. I ratti sono spesso un modello preclinico preferito e il robusto sistema di organoidi intestinali soddisfa la necessità di un sistema in vitro per accompagnare gli studi in vivo .

Generazione e manipolazione di organoidi intestinali di ratto

L'integrazione di organoidi intestinali canini e di un sistema microfluidico Gut-on-a-Chip offre modelli traslazionali rilevanti per le malattie intestinali umane. I protocolli presentati consentono la morfogenesi 3D e la modellazione dinamica in vitro dell'intestino, aiutando nello sviluppo di trattamenti efficaci per le malattie intestinali nei cani e negli esseri umani con One Health.

Morfogenesi tridimensionale nell'intestino su chip canino utilizzando organoidi intestinali derivati da pazienti con malattie infiammatorie intestinali

Gli enteroidi stanno emergendo come un nuovo modello per lo studio della fisiologia e della fisiopatologia dei tessuti, dello sviluppo di farmaci e della medicina rigenerativa. Qui, descriviamo un sistema di coltura derivato da enteroidi 2D di cellule primarie bovine che consente la co-coltura con i tipi di cellule tissutali rilevanti. Questo modello offre un vantaggio traslazionale per la modellazione della ricerca gastrointestinale.

Generazione di un sistema di coltura monostrato bidimensionale di derivazione enteroide primaria bovina per applicazioni nella ricerca biomedica traslazionale

Questo studio presenta un protocollo per la generazione di monostrati 2D intestinali bovini da organoidi, offrendo un migliore accesso per lo studio delle interazioni ospite-patogeno. Include metodi per valutare l'integrità e la funzionalità della membrana, avanzando modelli in vitro che imitano la fisiologia gastrointestinale del bestiame. Questo approccio promette significativi benefici biomedici e agricoli, tra cui strategie di trattamento avanzate.

Progressi nella tecnologia degli organoidi bovini utilizzando interfacce monostrato per l'intestino tenue e crasso

Questo video illustra la tecnica per estrarre il DNA dalla specie di microbi residenti nel hindgut termite. La preparazione di un vetrino a fresco, che è utile per visualizzare la comunità microbica intestinale è anche illustrato, e un tour attraverso le specie di ambiente ricco di intestino è dato.

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Scopri come sviluppare organoidi intestinali suini bidimensionali che replicano le proprietà fisiologiche dell'intestino nativo. Questo modello in vitro sostituisce gli esperimenti animali per studiare i meccanismi di trasporto gastrointestinale.

Organoidi intestinali suini bidimensionali che riflettono le proprietà fisiologiche dell'intestino nativo

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