Metodologia migliorata per l'erogazione di liquidi al polmone di topo: intubazione con un otoscopio consumer

[Annunciatore] Metodologia migliorata per l'erogazione di liquidi al polmone del topo. Intubazione con un otoscopio di consumo. Tutte le procedure sugli animali e questo contenuto sono stati esaminati dal Dipartimento di Medicina Comparata dell'Università di Tulane e sono approvati sul Protocollo 1810. Richiedi l'approvazione IACUC e consulta il personale veterinario del tuo istituto prima di continuare. Lo sviluppo di nuove terapie polmonari dipende da una somministrazione affidabile e ripetibile al polmone di topo, ma si è tradizionalmente basato sulla somministrazione intranasale, sull'aspirazione orofaringea mediante lingua completa o sul taglio chirurgico. Il seguente metodo ha ridotto la variabilità rispetto alla lingua piena, consentendo coorti di animali più piccole. È anche molto meno invasivo del taglio. Procedura, primo passo, configurazione. Il kit per l'intubazione dei roditori inizialmente utilizzava navi con cunei di sicurezza per l'intubazione. Si tratta di piccoli manicotti conici che si adattano a un catetere flessibile da 20 gauge e un pollice. Impediscono al catetere di danneggiare la carena. Pulisci un cuneo di sicurezza con un tampone di preparazione all'isopropanolo prima di usarlo. Far scorrere il cuneo di sicurezza pulito, qui verde, sulla cannula flessibile calibro 20. Raccogli gli altri strumenti necessari, tra cui un otoscopio commerciale, un telefono cellulare, un supporto per mouse con cono nasale, una pinza piegata e finemente seghettata, il tubo endotracheale e la luce a fibre ottiche, se utilizzata. Pulisci tutti questi con un tampone di preparazione all'isopropanolo prima dell'uso. Prendi un tubo flessibile di circa 20 centimetri. Piegalo a forma di U e aggiungi una connessione di blocco dell'esca su un'estremità. Fissare la forma a U con una fascetta. Aggiungere da due a 300 microlitri di acqua filtrata sterile o inchiostro di china al tubo. Di seguito, questo assemblaggio è indicato come tubo a bolle. Prendi un anello di sutura legando 13 centimetri di sutura di seta di taglia zero in un cerchio. Posiziona questo anello nella parte superiore del supporto del mouse e assicurati che entrambi i lati della sutura siano ben fissati. Posizionare il supporto del mouse sopra la base metallica della luce di ingrandimento. Posiziona le mani che aiutano intorno al punto in cui sarà la bocca del topo. Metti un mouse nella camera di induzione. Utilizzare ossigeno a portata costante a 0,8 litri al minuto e isoflurano al 2%. Anestetizzare il topo a sufficienza in modo da non svegliarsi durante il posizionamento del cono del naso. Non sopprimere in modo significativo la frequenza respiratoria del topo. Respiri regolari aiutano ad apprezzare le corde vocali. Collegare l'otoscopio al telefono cellulare e assicurarsi che il feed video sia stabile. Attenzione, per ridurre al minimo l'esposizione all'isofluorano del ricercatore durante questa procedura, utilizzare un respiratore chimico se si eseguono più intubazioni o si esegue una formazione su questo metodo. In alternativa, eseguire la procedura in un po' di legno. Fase due, la messa in scena degli animali. Prendi il primo animale dalla camera di induzione non appena si addormenta. Inseriscili e posiziona i denti superiori sulla lunghezza della sutura. Applicare una leggera tensione all'animale per mantenere il posizionamento della sutura mentre si appoggia il mouse sul supporto. Regolare l'angolo del manico leggermente all'indietro, posizionando il collo in estensione minore da cinque a 15 gradi. Spingi delicatamente il cono del naso sopra le narici. Non spingere con decisione il cono del naso verso il basso in quanto può interferire con la sutura che sospende il mouse. Usando una pinza piegata grande e finemente seghettata, afferra saldamente la lingua il più vicino possibile al labbro inferiore. Tirarlo con decisione verso il basso e allontanarlo dai denti superiori e verso il lato dei denti inferiori. Cautela, trazione prolungata, tensione eccessiva o schiacciamento della lingua possono compromettere la salute degli animali. Si prega di monitorare i segni di trauma tra cui lividi, sanguinamento, gonfiore o essiccazione della lingua. In caso di osservazioni, interrompere la procedura e allertare il personale veterinario. Se si utilizzano le mani che aiutano, sostenere la pinza in questa posizione. Alimentare la luce a fibre ottiche se utilizzata attraverso il catetere flessibile con il cuneo di sicurezza per l'intubazione in posizione. Fase tre, apprezzamento visivo delle corde vocali e intubazione. Con l'otoscopio nella mano non dominante, premere leggermente sulla lingua. Quindi inclina la fotocamera e la sua fonte di luce per visualizzare le corde vocali vicino alla base della lingua. A causa di lievi variazioni nell'anatomia e nel colore dei tessuti, utilizzare il movimento associato alla respirazione per confermare l'identificazione strutturale. All'inizio, orientarsi nel feed video può rivelarsi difficile. Queste sono le false corde vocali. Queste sono le vere corde vocali. Questo è il riflesso del tessuto buccale. Questa è la sonda e la luce in fibra ottica. Questa è l'epiglottide. Questo è il palato molle. Questa è la rima glottidis, il tuo obiettivo per l'intubazione. Questo è il labbro dell'otoscopio, che preme la lingua. Questa è la regione vietata. Con la luce a fibre ottiche accesa, se utilizzata, alimentare la cannula accanto all'otoscopio, entrando in contatto leggero con la base della lingua o la parte labiale dell'otoscopio. Per riferimento, regolare l'angolo di approccio del catetere in modo che sia molto basso. Subito dopo aver inserito il catetere, a meno di un millimetro oltre le corde vocali, sollevare la punta del catetere in modo che sia quasi parallela al piano del banco. Ciò impedisce all'epiglottide di forzare il catetere dorsalmente nell'esofago. Si noti che non dovrebbe esserci quasi nessuna resistenza durante l'avanzamento del catetere. In caso di resistenza, rimuovere immediatamente il catetere e consentire alla respirazione di tornare alla normalità. Se si osserva sanguinamento, consultare il personale veterinario. Fase quattro, conferma del posizionamento del tubo endotracheale. Oltre alla conferma visiva che il tubo si trova nella posizione corretta utilizzando l'otoscopio, la trachea fornisce meno resistenza durante il posizionamento rispetto all'esofago. La profondità di inserimento ottico è di circa cinque millimetri oltre le corde vocali. La luce può essere vista attraverso il collo come metodo secondario per confermare che la profondità di inserimento è appropriata. Si noti che il cuneo di sicurezza per l'intubazione deve evitare un'eccessiva profondità nel posizionamento del tubo endotracheale. Il cuneo di sicurezza previene il trauma alla corina, tuttavia non deve necessariamente impedire l'avanzamento. Quindi, tenendo il tubo endotracheale in posizione, rimuovere la luce a fibre ottiche. Confermare il posizionamento appropriato del catetere utilizzando il metodo del tubo a bolle. Fissare il tubo a bolle in posizione utilizzando il blocco inferiore. Il volume di marea dovrebbe essere immediatamente evidente. In caso contrario, il tubo endotracheale è mal posizionato. Rimuoverlo rapidamente e consentire al topo di tornare alla normale frequenza respiratoria. Fase cinque, parto intratracheale. Proprio come il metodo di estrazione della lingua per il parto orofaringeo, il parto tramite intubazione rischia di annegare l'animale. Nei topi adolescenti e adulti, 50 microlitri sono un volume di liquido generalmente sicuro da erogare ed è sufficiente per diffondersi nei polmoni. Se si utilizza una pipetta per la somministrazione, pipettare il volume desiderato direttamente nel catetere e lasciare che il topo inali la soluzione. Per garantire un'erogazione diffusa ai polmoni, oltre al liquido erogato nei polmoni con un massimo di 500 microlitri di aria. Se lo si desidera, è possibile eseguire più depressioni del pipettatore senza rischiare l'aspirazione negativa del liquido erogato. Si noti che l'uso di una quantità di volume superiore a quella corrente, circa 200 microlitri, può essere necessario quando si lava l'inoculo con aria. Tuttavia, l'uso di 500 microlitri non rischia traumi in quanto è solo circa la metà della capacità vitale. Fase sei, valutazione della consegna. Una luce a fibre ottiche portatile può essere realizzata con componenti economici e facilmente reperibili. È possibile utilizzare un gruppo in fibra ottica commerciale, come mostrato qui. Tuttavia, è sufficiente un coperchio del tubo conico da 50 ml con un foro praticato con un ago calibro 20 attraverso il quale viene alimentato un cavo in fibra ottica di plastica da 75 millimetri. In questo video sono stati utilizzati sia dispositivi commerciali che fatti a mano. Risultati rappresentativi, la somministrazione intratracheale mediante intubazione si traduce in una migliore erogazione e in una ridotta variabilità rispetto all'aspirazione orofaringea mediante trazione della lingua. Confronto diretto tra l'estrazione della lingua e l'intubazione guidata. Tre diversi ricercatori con livelli di esperienza sepolti o a cui è stato chiesto di somministrare in modo indipendente 50 microlitri di inchiostro di china diluito per via orofaringea mediante trazione della lingua a topi C57 BL/6J di età compresa tra 10 e 12 settimane di entrambi i sessi. Due ricercatori hanno anche somministrato lo stesso stock e volume di inchiostro al polmone tramite intubazione come descritto. I polmoni sono stati rimossi poco dopo il parto e fotografati con un ingrandimento 2x. Le fotografie sono state valutate per l'area macchiata da un ricercatore indipendente in cieco utilizzando l'immagine J. Ha scoperto che più area polmonare era macchiata se si utilizzava l'intubazione. Inoltre, la variabilità, espressa come deviazione percentuale dalla media, è stata ridotta se è stata utilizzata la somministrazione intratracheale dopo l'intubazione piuttosto che il tiro della lingua. Questa stazione utilizzata per l'intubazione guidata è preparata come mostrato. Da sinistra, pipette per l'erogazione, tubo a bolle per la conferma del corretto posizionamento del tubo endotracheale, pinze, spatola, speculum nasale pediatrico, mani di aiuto, luce di ingrandimento, supporto per mouse con cono nasale, sonda in fibra ottica e camera di induzione dell'anestesia. L'intubazione produce una maggiore erogazione al polmone con una minore variabilità rispetto all'aspirazione OP. A topi femmina di 10 settimane con valvola C è stata somministrata una volta 10 all'11° VG di luciferasi AIV 6.2 e valutati con imaging bioluminescente in vivo sette giorni dopo. 10 minuti prima dell'imaging, sono stati iniettati per via sottocutanea con luciferina. Vengono mostrate immagini rappresentative a-vis di topi che ricevono luciferasi AV 6.2 mediante aspirazione OP dopo estrazione della lingua o installazione intratracheale mediante intubazione. L'aspirazione orofaringea mediante trazione della lingua ha portato alla distribuzione del segnale in varie parti delle vie aeree superiori, mentre l'intubazione ha portato a un segnale concentrato nel polmone. Le regioni di interesse sono la stessa area e la radianza media all'interno della regione è mostrata nell'immagine. La quantificazione dei segnali della luciferasi ha rivelato una migliore efficienza di erogazione ai polmoni mediante intubazione e ha ulteriormente sottolineato la ridotta variabilità della somministrazione utilizzando questo metodo. Conclusione, come si vede nelle figure precedenti, l'inoculazione interpolmonare con il tradizionale metodo di estrazione della lingua mostra una distribuzione dell'inoculo irregolare e incoerente e una maggiore variabilità nella quantità che raggiunge i polmoni. Al contrario, il metodo di intubazione ha portato a un'erogazione più coerente sia al polmone destro che a quello sinistro ed è stato meno variabile. I risultati positivi di questo metodo di intubazione fortemente dimostrati sono, uno, l'installazione replicabile fino a 50 microlitri nei polmoni del topo, due, la distribuzione diffusa del liquido instillato in tutti i polmoni e tre, la ridotta diffusione dell'inoculo oltre i polmoni. Questo metodo è veloce, sicuro e può essere incorporato nelle procedure di laboratorio senza attrezzature costose o formazione dispendiosa in termini di tempo.