Name: Separazione e frazionamento delle proteine filtrate di coltura (CFP) da Mycobacterium tuberculosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Impara a separare le proteine filtrate di coltura di Mycobacterium tuberculosis mediante isoelettrico e SDS-PAGE. Questo metodo consente di identificare frazioni immunogeniche per lo sviluppo di diagnostici e vaccini contro la tubercolosi.

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<ol><li>Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+secreted+proteins+of+Mycobacterium+tuberculosis+by+a+bioinformatic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach.</a> Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).</li>
<li>de Souza, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+mass+spectrometry+analysis+as+a+tool+to+verify+and+improve+gene+annotation+using+Mycobacterium+tuberculosis+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">High-accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation using Mycobacterium tuberculosis as an example.</a> BMC Genomics. 9, 316(2008).</li>
<li>Lim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+new+T-cell-stimulating+antigens+from+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).</li>
<li>Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+proteomics+in+defining+the+T+cell+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 1 (5), 574-586 (2001).</li>
<li>Tucci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+proteomic+and+glycoproteomic+profiling+of+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrative proteomic and glycoproteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> PLoS One. 15 (3), e0221837(2020).</li>
<li>Deenadayalan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoproteomic+identification+of+human+T+cell+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis+that+differentiate+healthy+contacts+from+tuberculosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).</li>
<li>Yasuda, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cytokine+profiles+related+to+Mycobacterium+tuberculosis+latent+antigens+using+a+whole-blood+assay+in+the+Philippines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cytokine profiles related to Mycobacterium tuberculosis latent antigens using a whole-blood assay in the Philippines.</a> Front Immunol. 15, 1330796(2024).</li>
<li>Målen, H., Søfteland, T., Wiker, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis+H37Rv+culture+filtrate+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins.</a> Scand J Immunol. 67 (3), 245-252 (2008).</li>
<li>Bekmurzayeva, A., Sypabekova, M., Kanayeva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis+diagnosis+using+immunodominant%2C+secreted+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (4), 381-388 (2013).</li>
<li>Rodríguez-Hernández, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+antigenic+biomarkers+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Zhejiang+Univ+Sci+B%22%5BJournal%5D)">Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).</li>
<li>Mustafa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+biological+characterization+of+Mycobacterium+tuberculosis-specific+ESAT6-like+proteins+and+their+potentials+in+the+prevention+of+tuberculosis+and+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Princ+Pract%22%5BJournal%5D)">Chemical and biological characterization of Mycobacterium tuberculosis-specific ESAT6-like proteins and their potentials in the prevention of tuberculosis and asthma.</a> Med Princ Pract. 32 (4-5), 217-224 (2023).</li>
<li>Rosenkrands, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+proteome+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Towards the proteome of Mycobacterium tuberculosis.</a> Electrophoresis. 21 (17), 3740-3756 (2000).</li>
<li>Jungblut, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteome+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+Mycobacterium+bovis+BCG+strains%3A+Towards+functional+genomics+of+microbial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG strains: Towards functional genomics of microbial pathogens.</a> Mol Microbiol. 33 (6), 1103-1117 (1999).</li>
<li>Lim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+new+T-cell-stimulating+antigens+from+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).</li>
<li>Rodríguez-Hernández, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+antigenic+biomarkers+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Zhejiang+Univ+Sci+B%22%5BJournal%5D)">Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).</li>
<li>Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+proteomic+analysis+of+preparative+isoelectric-focusing+separated+culture+filtrate+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&Auml; Sistema di filtrazione a flusso tangenziale KTA flux&nbsp;</td><td>CYTIVA</td><td>29038437</td><td></td></tr><tr><td>Anfoliti (pH da 3,0 a 10,0 )</td><td>BIO-RAD</td><td>1632094</td><td></td></tr><tr><td>Anfoliti (pH da 4,0 a 6,0 )</td><td>BIO-RAD</td><td>1631143</td><td></td></tr><tr><td>Saggio delle proteine BCA&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>71285-M</td><td></td></tr><tr><td>TAPPI</td><td>MERCK</td><td>C2632</td><td></td></tr><tr><td>Idrolizzato di caseina</td><td>MERCK</td><td>65072-00-6</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>MERCK</td><td>Codice: C0759</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>MERCK</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>MERCK</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di ammonio ferrico</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM10944</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>MERCK</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>MERCK</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Lowenstein-Jensen inclinazioni&nbsp;</td><td>HIMEDIA</td><td>SL001</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>MERCK</td><td>Visualizzazione del materiale M7506</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di filtrazione sottovuoto a sgancio rapido Millipore Stericup</td><td>MERCK</td><td>S2HVU11RE</td><td></td></tr><tr><td>Acido fosforico&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>695017</td><td></td></tr><tr><td>Ortofosfato monobasico di potassio</td><td>MERCK</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>484016</td><td></td></tr><tr><td>Cella preparativa IEF (Rotofor)&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>170-2986&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>Episodio 2002</td><td></td></tr><tr><td>Glutammato di sodio</td><td>MERCK</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>HIMEDIA</td><td>MB095</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>MERCK</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>MERCK</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Intero Gel Eluter apparato&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651250</td><td></td></tr></tbody></table>

separazione e frazionamento delle proteine filtrate di coltura (cfp) da mycobacterium tuberculosis

Separation and Fractionation of Culture Filtrate Proteins (CFPs) from Mycobacterium tuberculosis

La Figura 1 illustra la complessità delle proteine filtrate di coltura (CFP) preparate. Inizialmente, 100 μg di CFP sono stati sottoposti all'analisi 2D-SDS PAGE per valutarne la complessità. Questa analisi ha rivelato la presenza di quasi 100 macchie proteiche distinte nella CFP (Figura 1).
Le 20 frazioni raccolte da ogni corsa sono state analizzate da SDS-PAGE. Di queste, tre frazioni rappresentative di tre diverse esecuzioni sono m...

Separazione e frazionamento delle proteine filtrate di coltura (CFP) da Mycobacterium tuberculosis

Secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) play a crucial role in tuberculosis pathogenesis, immune modulation, and disease ...

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolamento e caratterizzazione di vescicole extracellulari prodotte da micobatteri limitati al ferro. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra l'isolamento graduale di vescicole extracellulari (EV) da Mycobacterium tuberculosis coltivate in condizioni limitanti il ferro che imitano l'ambiente ospite. Descrive l'uso dell'ultrafiltrazione, della centrifugazione differenziale e della separazione in gradiente di densità per arricchire e identificare le frazioni...

Isolamento di vescicole extracellulari contenenti siderofori da Mycobacterium tuberculosis

Questo video dimostra la separazione degli acidi micolici basata sulla cromatografia su strato sottile. Questa tecnica separa i diversi acidi micolici, lipidi a catena lunga presenti nella parete cellulare dei micobatteri, in base alla loro polarità.

Separazione basata sulla cromatografia su strato sottile di varianti di acido micolico: un metodo per separare i lipidi della parete cellulare micobatterica in base alla polarità

Questo video dimostra l'isolamento e la concentrazione delle proteine filtrate della coltura batterica, che includono vescicole extracellulari batteriche, utilizzando l'ultrafiltrazione. Le vescicole extracellulari concentrate fungono da marcatori diagnostici per il rilevamento della malattia.

Concentrazione di proteine filtrate per colture batteriche utilizzando un dispositivo di ultrafiltrazione

Questo video mostra la tecnica di cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) per purificare le vescicole extracellulari batteriche (EV) dal filtrato di coltura di Mycobacterium tuberculosis (Mtb). La tecnica utilizza una colonna porosa impaccata di resina per ottenere frazioni purificate di EV. Le particelle porose consentono selettivamente alle proteine più piccole di entrare nei pori, con conseguente eluizione più lenta. Allo stesso tempo, le vescicole extracellulari sono escluse...

Una tecnica di cromatografia ad esclusione dimensionale per purificare le vescicole extracellulari micobatteriche

L'obiettivo è frazionare e isolare piccole molecole bioattive, peptidi da un complesso estratto vegetale e proteine da microbi patogeni utilizzando il metodo di messa a fuoco isoelettrica a fase liquida (IEF). Inoltre, sono state identificate le molecole separate e la loro bioattività è stata confermata.

Separazione delle piccole molecole bioattive, Peptidi da fonti naturali e proteine dai microbi di Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Metodo

La quantificazione rapida ed efficiente della crescita intracellulare di M. tuberculosis è fondamentale per perseguire terapie migliori contro la tubercolosi (TB). Questo protocollo descrive un test di rilevamento colorimetrico basato sul brodo utilizzando un sistema di coltura liquida automatizzato per quantificare la crescita di Mtb nei macrofagi trattati con terapie candidate dirette dall'ospite.

Un sistema di coltura automatizzato da utilizzare nei test preclinici di terapie dirette all'ospite per la tubercolosi

I batteri secernono vescicole extracellulari (EV) di dimensioni nanometriche che trasportano molecole biologiche bioattive. La ricerca EV si concentra sulla comprensione della loro biogenesi, del ruolo nelle interazioni e malattie microbo-microbo e ospite-microbo, nonché sulle loro potenziali applicazioni terapeutiche. Viene presentato un flusso di lavoro per l'isolamento scalabile dei veicoli elettrici da vari batteri per facilitare la standardizzazione della ricerca sui veicoli elettrici.

Isolamento scalabile e purificazione di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri

Questo protocollo descrive la cromatografia di esclusione dimensionale, una tecnica facile e riproducibile per arricchire le vescicole extracellulari del Mycobacterium tuberculosis dai supernatanti di coltura.

Mycobacterium tuberculosis Arricchimento delle vescicole extracellulari attraverso la cromatografia di esclusione dimensionale

Questo protocollo descrive in dettaglio l'arricchimento di vescicole extracellulari micobatteriche native (mEV) da colture axeniche di Mycobacterium smegmatis (Msm) e come possono essere progettate e arricchite le MsmEV ricombinanti contenenti mCherry (un reporter fluorescente rosso). Infine, verifica il nuovo approccio con l'arricchimento di MsmEVs contenenti la proteina EsxA di Mycobacterium tuberculosis.

Arricchimento di vescicole extracellulari native e ricombinanti di micobatteri

Qui, dimostriamo la preparazione del filtrato di coltura di Mtb (CF), che è il mezzo di crescita batterico costituito da proteine secrete dai batteri. Mtb secerne proteine per modulare la segnalazione dell'ospite e la risposta immunitaria, che sono cruciali per la patogenesi. Le FC preparate vengono analizzate mediante spettrometria di massa per identificare tutti i fattori secretori.

Preparazione del filtrato di coltura di Mycobacterium tuberculosis per comprendere la patogenesi della tubercolosi

Questo protocollo separa le proteine insolubili della parete cellulare e della membrana in frazioni semplici (1-5 proteine) utilizzando la focalizzazione isoelettrica preparativa (IEF) basata sul punto isoelettrico, seguita dalla separazione per peso molecolare. Le frazioni risultanti possono essere utilizzate direttamente per analisi immunologiche e proteomiche senza ulteriore purificazione.

Separazione e frazionamento delle proteine della parete cellulare e della membrana cellulare da Mycobacterium tuberculosis per l'analisi delle proteine a valle

Impara a separare le proteine filtrate di coltura di Mycobacterium tuberculosis mediante isoelettrico e SDS-PAGE. Questo metodo consente di identificare frazioni immunogeniche per lo sviluppo di diagnostici e vaccini contro la tubercolosi.

Separazione e frazionamento delle proteine filtrate di coltura (CFP) da Mycobacterium tuberculosis

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